The use of species-specific ELISAs and bioassays for the purpose of detecting pyrogenic contaminations

Abstract

In this study the reaction of the blood monocytes of rabbits and humans towards pyrogens (fever-inducing substances) was compared. Pyrogens in intravenously applied parenterals are being recognized by blood monocytes and induce the production of cytokines which cause a fever reaction in the organism. The fever reaction of rabbits has been used since 1942 for testing drugs for pyrogenic contaminations. A new in vitro pyrogen test (IPT) which measures the cytokine production of human monocytes in vitro in an ELISA system was recently validated and introduced. ELISAs for the rabbit were developed in order to compare the reaction of both species in vitro. The first question that was addressed was whether the cytokine production of the monocytes of the rabbit corresponded to the in vivo fever reaction. This was the case. The required amount of pyrogen in vivo corresponded exactly to the amount in vitro. Having that established, the in vitro pyrogen test using human whole blood was compared to the reaction of rabbit whole blood. The human and the rabbit whole blood test were performed in parallel, whenever possible. A comparison of these two assays revealed a very high similarity in the reactivity between both species, but the rabbit appeared less sensitive towards 3 stimuli. The humans had a more uniform response and sensitivity towards all stimuli used than had the rabbits, the different donors as well as the different endpoints, IL-, IL-6, TNF- and IL-8. The amount of pyrogens that was necessary to evoke a cytokine production varied between picograms, nanograms and even micrograms depending on the stimulus. Since the dog as well had once been discussed as an animal for pyrogen testing, a bioassay for canine blood was established and successfully compared to the corresponding bioassay using human blood. Testing for pyrogenic contaminations is a major issue in human medicine. The in vitro pyrogen tests reliably detect pyrogenic contaminations in parenterals. From our perspective, the already established readouts, and, if necessary, further developments of species-specific ELISAs and bioassays could prove valuable for ensuring drug safety in the veterinary field.

In dieser Arbeit wurde die Reaktion der Blutmonozyten von Kaninchen und Mensch auf Pyrogene (fiebererzeugende Substanzen) verglichen. Pyrogene in intravenös applizierten Parenteralia werden von Blutmonozyten erkannt und führen zur Ausschüttung von Zytokinen, die im Organismus Fieber verursachen. Die Fieberreaktion von Kaninchen wird seit 1942 genutzt, um Medikamente auf pyrogene Kontaminationen zu prüfen. Ein neuer in vitro Pyrogentest (IPT), der die Zytokinausschüttung humaner Monozyten in vitro im ELISA misst, wurde kürzlich erfolgreich validiert und eingeführt. ELISAs für das Kaninchen wurden entwickelt, um die Reaktion beider Spezies in vitro zu vergleichen. Die erste Frage, die sich stellte war, ob die Zytokinausschüttung der Blutmonozyten des Kaninchens im in vitro pyrogen test mit der in vivo Fieberreaktion des Gesamt- organismus zusammenhing. Dies konnte bestätigt werden. Die notwendige Menge an Pyrogen in vivo stimmte mit der in vitro genau überein. Mit diesem Ergebnis wurde dann der neu entwickelte in vitro Pyrogentest mit Humanblut mit dem in vitro Pyrogentest mit Kaninchenblut verglichen. Beide Tests wurden, wann immer möglich, parallel durchge-führt. Ein Vergleich der beiden Assays ergab eine sehr hohe Ähnlichkeit bezüglich der Sensitivität beider Spezies, allerdings erschien das Kaninchen bei drei Stimuli weniger sensitiv. Die Humanspender hatten eine einheitlichere Reaktion und Sensitivität allen Stimuli gegenüber als die Kaninchen, und zwar galt sowohl für die verschiedenen Spender untereinander als auch für die verschiedenen gemessenen Zytokine, IL-1, IL-6, TNF- und IL-8. Die Menge an Pyrogenen, die eingesetzt werden musste, um eine Zytokinausschüttung hervorzurufen, bewegte sich je nach Stimulus im Pikogramm-, Nanogramm- oder sogar Mikrogrammbereich. Da auch der Hund als Versuchstier zur Pyrogentestung diskutiert wurde, wurde noch ein Bioassay für Hundeblut etabliert und erfolgreich mit dem entsprechenden Assay mit Humanblut verglichen. Die Testung auf pyrogene Kontaminationen ist ein großes Thema in der Humanmedizin. Die in vitro Pyrogentests entdecken verlässlich pyrogene Kontaminationen in Parenteralia. Aus unserer Sicht könnten sich die bereits etablierten Endpunkte und, falls nötig, weitere Entwicklungen spezies- spezifischer ELISAs und Bioassays als nützlich erweisen, um die Sicherheit von Parenteralia im Veterinärbereich zu gewährleisten.