Mechanism of action of Viscum album L. extracts in Ewing sarcoma

Abstract

Ewing sarcoma is the second most common bone cancer in children and adolescents. It has a poor prognosis and outcome. Therefore, drug discovery of new anti-tumor agents is still crucial to improve survival of Ewing sarcoma patients. Combining active substances may be beneficial since some drug combinations are able to enhance each other creating synergistic effects. Natural substances in plant extracts contain diverse cytotoxic compounds and provide potential active ingredients for tumor therapy. The European mistletoe (Viscum album L.) contains hydrophobic triterpene acids and hydrophilic lectins and viscotoxins, which all possess anti-cancer properties. Standardized commercial Viscum album L. extracts are aqueous, excluding the insoluble triterpenes. However, triterpene acids can be solubilized by using cyclodextrins. By combining a solubilized mistletoe triterpene extract (TT) with an aqueous mistletoe extract (viscum) a total mistletoe effect was obtained (viscumTT) and the mechanism of action of viscum, TT and viscumTT was analyzed in Ewing sarcoma cells. In vitro and ex vivo treatment of Ewing sarcoma cells with viscum inhibited proliferation and induced apoptosis in a dose-dependent manner, while the TT extract displayed only moderate pro- apoptotic properties. Importantly, viscumTT combination treatment generated a synergistic effect. Viscum- and viscumTT-induced apoptosis occurred via the intrinsic and extrinsic apoptotic pathway, evidenced by the depolarization of mitochondria membrane and the activation of caspase 8 and 9. Additionally, the antitumor activity of viscum and viscumTT was validated in a Ewing sarcoma mouse model in vivo. A deeper assessment of the molecular mechanisms of viscum, TT and viscumTT treatment leading to apoptosis in vitro revealed a balance shift of anti-apoptotic/ pro-survival regulatory proteins towards the pro-apoptotic state, mainly via MCL1, CLSPN, BIRC5 and XIAP downregulation. Moreover, the transcriptomic and proteomic profile of Ewing sarcoma cells showed strong alterations evoking a transcriptional upregulation of stress- activated and apoptosis-associated genes accompanied with an upregulation of proteasomal proteins and a downregulation of ribosomal and spliceosomal proteins. Furthermore, the extracts triggered the activation of the unfolded protein response. While viscum and viscumTT displayed also response to oxidative stress and the activation of stress-mediated MAPK signalling, the TT extract indicated the involvement of TLR signalling and autophagy. Since the combinatory viscumTT extract displayed phytopolychemotherapeutic properties and demonstrated a potent pro-apoptotic impact, it may represent an adjuvant therapy option for paediatric patients with Ewing sarcoma. In any case, this work contributes to an improved understanding on the mechanism of action of Viscum album L. extracts.

Das Ewing-Sarkom stellt den zweithäufigsten Knochentumor bei Kindern und Jugendlichen dar und ist mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. Somit ist die Erforschung und Entwicklung neuer therapeutischer Agenzien weiterhin essentiell, um das Überleben von Patienten mit einem Ewing-Sarkom zu verbessern. Die Kombination mehrerer Wirkstoffe kann vorteilhaft sein, da einige Kombinationen sich gegenseitig verstärken können und so synergistische Effekte hervorrufen. Pflanzen enthalten diverse natürlich vorkommende zytotoxische Substanzen und liefern dadurch potentielle Wirkstoffe für die Tumortherapie. Die europäische Mistel (Viscum album L.) enthält als anti- kanzerogene Substanzen die lipophilen Triterpensäuren sowie die hydrophilen Mistellektine und Viscotoxine. Standardisierte, kommerziell erhältliche Viscum album L. Extrakte sind jedoch auf wässriger Basis und enthalten deshalb keine Triterpensäuren. Diese können aber durch die Verwendung von Cyclodextrinen solubilisiert werden. Durch die Kombination eines triterpenhaltigen Mistelextrakts (TT) mit einem wässrigen Mistelextrakt (viscum) wurde ein Mistel-Gesamtextrakt (viscumTT) erhalten und der Wirkmechanismus von viscum, TT und viscumTT im Ewing-Sarkom-Modell untersucht. Die Behandlung der Ewing- Sarkom Zellen mit den Extrakten in vitro und ex vivo zeigte, dass viscum konzentrationsabhängig die Proliferation inhibierte und die Apoptose induzierte, während TT nur schwache pro-apoptotische Eigenschaften aufwies. Zudem zeigte sich, dass der kombinatorische Extrakt viscumTT synergistisch Apoptose induziert. Die durch viscum und viscumTT vermittelte Apoptose erfolgte dabei sowohl durch den intrinsichen als auch den extrinsichen Apoptoseweg, was durch die Absenkung des Mitochondrienmembranpotentials und die Aktivierung der Caspase-8 und Caspase-9 belegt wurde. Die anti- kanzerogenen Eigenschaften von viscum und viscumTT wurden auch in einem Ewing- Sarkom-Mausmodell in vivo nachgewiesen. Tiefer gehende Untersuchungen des molekularen Wirkmechanismus von viscum, TT und viscumTT in vitro zeigten eine Verschiebung von anti-apoptotischen Proteinen zugunsten der Apoptose, die sich in der Abnahme der Proteinexpression von MCL1, CLSPN, BIRC5 und XIAP äußerte. Zudem führten die Extrakte zu einer starken Veränderung des Transkriptom- und Proteom-Profils, wobei sie die transkriptionelle Hochregulation von Stress- aktivierten und Apoptose-assoziierten Genen bewirkten, sowie die Zunahme von proteasomalen Proteinen und die Abnahme von ribosomalen und spliceosomalen Proteinen auslösten. Außerdem lösten die Extrakte eine Antwort auf ungefaltete Proteine (unfolded protein response) aus. Weiterhin wurde gezeigt, dass viscum und viscumTT oxidativen Stress und die Aktivierung des Stress-vermittelten MAPK Signalwegs verursachen, während die Behandlung mit dem TT Extrakt auf die Beteiligung des TLR Signalwegs und der Autophagie hindeutet. Da vor allem der kombinatorische Extrakt viscumTT potente pro-apoptotische Eigenschaften in Ewing-Sarkom Zellen zeigte, könnte dieser als eine Art Phytopolychemotherapie eine zusätzliche, adjuvante Therapieoption für pädiatrische Patienten mit einem Ewing-Sarkom darstellen. In jedem Fall trägt die vorliegende Arbeit zu einem besseren Verständnis des Wirkmechanismus von Viscum album L. Extrakten bei.