Molecular determinants of the β4 nAChR subunit in channel function and nicotine-mediated behavior

Abstract

These studies establish that the β4 nicotinic receptor subunit regulates nicotine intake and nociception in mice and identify the residues in this molecule that control α3β4 nAChR channel activity. One of these residues is native and unique in β4 and confers its ability to potentiate currents to the highly homologous and most abundant beta nAChR subunit, β2. The other four residues correspond to SNP variants found in humans, two of which have been linked to reduced risk of nicotine dependence. Prompted by the discovery, that Tabac mice, overexpressing the β4 nAChR subunit in MHb neurons, display strong aversion to nicotine [Frahm et al., 2011], the studies presented here provide in vitro evidence that increasing levels of β4 nAChR gradually elevate nicotine-elicited currents of α3β4 nAChR subunit combination. Further, analyses of β2/β4 chimeric nAChR subunits revealed, that the ability of β4 to enhance nicotine-evoked currents depends on a single critical residue (S435) located within the membrane-associated stretch in the intracellular vestibule of the receptor. Interestingly, sequence alignments revealed that 6 SNPs map to this region, one of them being the most common SNP associated with tobacco usage, D398N in the α5 subunit [Bierut et al., 2008]. Functional analyses of these and other SNPs mapping to the intracellular vestibule in Xenopus laevis oocytes demonstrated that single mutations in this domain can result in profound effects on nicotine-evoked currents. For example, the D444Y variant in β4 (D447Y in mouse) caused a major increase in nicotine-evoked currents, whereas the D398N α5 variant (D397N in mouse) strongly depresses nicotine- evoked currents. Next, this study aimed to determine the influence of D447Y variant and other single nucleotide polymorphisms in the coding region of β4 nAChR subunit to channel function in response to nicotine, as well as how this translated into nicotine-mediated behavior. Upon assaying them for response to nicotine in oocytes as well as in dissociated rat hippocampal neurons, three additional β4SNPs with altered responses to nicotine were selected for further studies. Medial habenula is one of a few discrete expression sites of α3β4 nAChR combination and has been linked to both nicotine consumption and pain modulation [Hikosaka, 2010]. Therefore lentiviruses carrying the wild-type β4 subunit as well as the functionally distinct β4 rare missense variants were injected using stereotactic coordinated into medial habenula. Behavioral analysis showed, that mice overexpressing the β4T374I polymorphism in the MHb display strong aversion to nicotine in free-choice nicotine drinking test, whereas lentiviral delivery of β4D447Y subunit into MHb resulted in decreased sensitivity to mechanical and thermal nociceptive stimuli, as well as decreased response to acute inflammatory pain and reduced peripheral nerve injury-induced hyperalgesia. Altogether, these studies are consistent with our previous results in Tabac mice showing that that increased α3β4 nAChR currents in the medial habenula result in nicotine aversion. Likewise the β4T374I variant, which increases currents, results in nicotine aversion while the R348C variant, which decreases currents, results in preference for nicotine in medial habenula injected mice. In addition, these studies provide, for the first time, molecular evidence that increased α3β4 - mediated currents in the medial habenula produce significant analgesia, thus indicating a relevant role of habenular cholinergic neurons in central pain processing.

Nikotinerge Azetylcholin Rezeptoren spielen eine wesentliche Rolle im Tabak- Konsum und Nikotin-Abhängigkeitsverhalten. Vor 4 Jahren wurden bei Rauchern erstmals Variationen in Genen entdeckt, die für die Expression des azetylcholinergen Rezeptors verantwortlich sind. Dabei handelt es sich speziell um eine Gruppe von 3 benachbarten Genen, die für die Untereinheiten α3, α5 und β4 des Azetylcholinrezeptors kodieren. Zusammen bilden diese Untereinheiten eine von vielen möglichen Varianten des heteromeren Azetylcholinrezeptors, ein Ionenkanal der spezifisch und gehäuft in der medialen Habenula vorkommt. Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) in diesen Genen können bei Rauchern direkt mit der Menge gerauchter Zigaretten pro Tag korreliert werden. Anlässlich der Entdeckung, dass eine Überexpression von β4 in der medialen Habenula von transgenen Mäusen (genannt Tabac-Mäuse) eine ausgeprägte Aversion gegen Nikotin erzeugt46, wurde in der vorliegenden Arbeit in vitro gezeigt, wie eine Erhöhung der relativen Menge an β4-cRNA einen graduellen Anstieg der Anzahl von funktionellen α3β4 nAChR-Rezeptoren hervorruft. Mithilfe elektrophysiologischer Untersuchungen an Xenopus laevis Oozyten konnte eine einzelne Aminosäure (S435) in der intrazellulären Domäne der β4-Untereinheit identifiziert werden, die für diese Erhöhung der Azetylcholinrezeptor-Dichte und der damit verbundenen Potenzierung der Einwärts-gerichteten Ströme verantwortlich ist. Interessanterweise ergaben Sequenz-Abgleichungs-Analysen, dass 6 SNPs des heteromeren Azetylcholinrezeptors in demselben intrazellulären Abschnitt wie S435 vorkommen, von denen D398N in der α5-Untereinheit den häufigsten Polymorphismus im Zusammenhang mit Nikotin-Abhängigkeit darstellt. Funktionelle Analysen dieses und der 5 anderen SNPs ergaben, dass einzelne Mutationen in diesem Bereich erheblichen Einfluss auf Nikotin-evozierte Einwärts-Ströme haben. Zum Beispiel verursacht die D444Y Variante in β4 (D447Y in der Maus) eine Erhöhung der Einwärts-Ströme, wohingegen die D398N α5-Variante (D397N in der Maus) Nikotin-evozierte Ströme erheblich verkleinert. Darauf aufbauend wurde im Mausmodell erforscht, wie sich verschiedene SNPs des β4-Gens (Chrnb4) auf die Rezeptor-Funktion bzw. auf das Verhalten auswirken. Die mediale Habenula ist eine der wenigen Gehirnregionen, die die α3β4 Rezeptor-Kombination exprimieren, welche kürzlich mit Nikotin- Konsum- sowie Schmerz-Verhalten in Zusammenhang gebracht werden konnte. Daher wurden Lentiviren, die die Wildtyp-Variante der β4-Sequenz oder eine der seltenen β4 Missense Varianten kodieren, in die mediale Habenula von Mäusen stereotaktisch injiziert. In Verhaltenstests konnte gezeigt werden, dass Mäuse die den β4 T374I Polymorphismus in der medialen Habenula überexprimieren, eine ausgeprägte Aversion gegenüber Nikotin-haltigem Trinkwasser aufwiesen, während diejenigen Mäuse die die β4 D447Y-Variante trugen, eine verringerte Sensitivität gegenüber mechanischen und thermalen Stimuli, sowie geringere Reaktionen auf inflammatorischen Schmerz und reduzierte verletzungsbedingte Hyperalgesie zeigten. Insgesamt sind die vorgestellten Ergebnisse in Einklang mit unseren vorherigen Erkenntnissen aus Tabac Mäusen, bei denen erhöhte 34-Ströme in der medialen Habenula mit einer ausgeprägten Nikotin-Aversion einhergehen. Dementsprechend verursacht die β4T374I Variante, welche erhöhte Ströme bewirkt, Nikotin-Aversion, während die R348C Variante, welche reduzierte Ströme bewirkt, in einer Präferenz für Nikotin resultiert. Ausserdem konnte in dieser Studie zum ersten Mal auf molekularer Ebene ein Zusammenhang zwischen erhöhten α3β4-Strömen in der medialen Habenula und Analgesie gezeigt werden, wodurch den cholinergen Neuronen in der Habenula eine relevante Bedeutung in der zentralen Schmerzverarbeitung zukommt.