Functional detection of botulinum neurotoxin serotypes A-F by monoclonal neoepitope-specific antibodies

Abstract

Botulinum neurotoxins (BoNTs) represent the most poisonous substances known and cause the rare but potentially life-threatening disease botulism. Diagnostics of botulism is a highly challenging task, as minute amounts of more than 40 different BoNT sero- and subtypes must be detected from complex sample matrices. To date, the gold-standard method for BoNT detection is still the ethically controversial mouse bioassay. BoNTs’ high toxicity is mediated by an exquisite neurospecificity, determined by specific binding to neuronal receptors, combined with enzymatic cleavage of proteins involved in neurotransmitter release at serotype specific cleavage sites. Thus, enzymatically active BoNT can be monitored by substrate cleavage, while different serotypes can be distinguished by detection of the exact cleavage site. In this work, functional in vitro approaches for highly sensitive detection of all clinically relevant BoNT serotypes A-F were established. To that aim, neoepitope specific antibodies (Neo-mAbs), recognizing the serotype specific cleavage sites of BoNT/A-F on their synaptic substrate molecule, were generated and thoroughly characterized. To achieve maximum sensitivity, cleavage conditions of all BoNT serotypes were optimized by statistical means. High affinity Neo-mAbs as well as optimal cleavage conditions were implemented in two distinct assay platforms enabling detection of BoNT/A-F: An Endopeptidase-ELISA for straightforward toxin detection and a novel LuminexTM duplex-assay for simultaneous detection of two distinct BoNTs. Furthermore, as an additional step of BoNT action, receptor binding was integrated in the duplex-assay for BoNT/A and B. All assays exhibited sensitivities comparable to the mouse bioassay and could detect BoNT from different complex matrices such as serum and foods. The unique tools generated in this work together with the established assay platforms therefore represent a major step forward towards the replacement of the mouse bioassay for botulism diagnostics.

Botulinum Neurotoxine (BoNTs) sind die giftigsten bekannten Substanzen und lösen das seltene, aber lebensbedrohliche neurologische Krankheitsbild Botulismus aus. Die Diagnostik von Botulismus stellt eine große Herausforderung dar, da geringe Toxin-Konzentrationen von über 40 verschiedenen BoNT Sero- und Subtypen sicher aus komplexen Matrizes erfasst werden müssen. Obwohl der Maus-Bioassay ethisch umstritten ist, wird er daher immer noch in der Routinediagnostik als Goldstandard verwendet. Die hohe Toxizität von BoNT begründet sich durch eine hochspezifische Bindung an neuronale Rezeptoren sowie der enzymatischen Aktivität. Letztere ist durch die Spaltung bestimmter an der Neurotransmitter-Ausschüttung beteiligter Proteine charakterisiert. Dabei spalten alle BoNTs bestimmte Substratproteine Serotyp-spezifisch an einer einzigen Peptidbindung. Die Detektion der spezifischen Spaltstellen auf den jeweiligen Substratproteinen ermöglicht somit zum einen die Unterscheidung einzelner Serotypen und zum anderen die Darstellung der enzymatischen Aktivität von BoNT. In diesem Zusammenhang wurden in der vorliegenden Arbeit funktionelle in vitro-Methoden entwickelt, um alle klinisch relevanten BoNT Serotypen A-F hochsensitiv zu erfassen. Dafür wurden zunächst Neoepitop-spezifische monoklonale Antikörper (Neo-mAK) hergestellt und umfassend charakterisiert. Diese erkennen hochspezifisch durch BoNT geschnittenes Substrat, während ungeschnittene Substrate jeweils nicht erkannt werden. Des Weiteren wurden mit Hilfe eines statistischen Ansatzes erstmals optimale Spaltungsbedingungen für alle BoNT-Serotypen etabliert. Für den Nachweis von katalytisch aktiven BoNT/A-F wurden hochaffine Neo-mAKs sowie optimale Spaltungsbedingungen in zwei unterschiedliche Verfahren implementiert. Zum einen wurde ein Endopeptidase-ELISA entwickelt, der einen technisch einfachen Toxin Nachweis ermöglicht. Zum anderen wurde ein neuer Duplex-Assay, basierend auf der LuminexTM-Technologie etabliert, der erstmalig die parallele Erfassung zwei verschiedener Serotypen mittels Neo-mAK ermöglicht. Um einen weiteren funktionellen Aspekt des BoNT-Wirkungsmechanismus in vitro abzubilden, wurde zudem die Bindung von BoNT an seinen natürlichen neuronalen Rezeptor für BoNT/A und B im Duplex-Assay integriert. Die etablierten Methoden zeigten ähnliche oder deutlich höhere Sensitivitäten wie der Maus-Bioassay. Des Weiteren gelang es mit allen Verfahren, BoNT aus verschiedenen komplexen Matrices hochsensitiv nachzuweisen. Die in der Arbeit hergestellten einmaligen Reagenzien sowie die neu etablierten Nachweisverfahren leisten daher einen wichtigen Beitrag, um den Maus-Bioassay in der Botulismus-Diagnostik mittelfristig durch ein in vitro-Verfahren ersetzen zu können.