Charakterisierung der Histondemethylase JMJD1A als neues Zielgen von HIF-1

Abstract

Hypoxie stellt eine Gefahr für die zelluläre Integrität der meisten Organismen dar und beeinflusst die zellulären Funktionen in vielfältigster Art und Weise, unter anderem durch Modifizierung der Chromatinstruktur und durch komplexe Veränderungen der Genexpression. Viele dieser Adaptationsprozesse, die letztendlich dem Überleben der Zelle dienen, werden direkt oder indirekt durch den Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktor 1 (HIF-1) vermittelt. Die Histondeme-thylase Jumonji domain containing protein 1A (JMJD1A) aktiviert durch spezifische Demethyla-seaktivität an Mono- und Dimethylgruppen von H3K9 (Histon 3 Lysin 9) die Genexpression verschiedener Zielgene und fungiert somit seinerseits als Transkriptionsmodulator. Die Zielsetzung dieser Arbeit war es, den Einfluss von Hypoxie im Allgemeinen und die Rolle von HIF-1 im Speziellen auf die Expression der Histondemethylase JMJD1A zu untersuchen. Mittels quantitativer RT-PCR konnte anhand unterschiedlicher humaner Zelllinien und verschiedener humaner und muriner Gewebe eine signifikante Zunahme der JMJD1A Transkription unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie nachgewiesen werden. Western-Blot-Untersuchungen ergaben, dass sich diese Induktion auch auf Proteinebene widerspiegelt Die gezielte Blockade des HIF-1 Signalweges in humanen Endothelzellen mittels spezifischer gegen HIF-1α mRNA gerichteter siRNA-Konstrukte zeigte, dass HIF-1 notwendig ist für die sauerstoffabhängige Induntion von JMJD1A. Durch Klonierung und gezielte Mutationsanalysen zahlreicher Promotorkon-strukte ließ sich in Reportergenassay-Analysen zeigen, dass HIF-1α durch direkte Interaktion mit nur einem Hypoxie-responsiven Element (HRE), 1208 bp vor dem JMJD1A Startkodon gelegen, die Expression von JMJD1A sowohl unter Hypoxie als auch unter dem Einfluss von Eisenchelatoren induziert. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, das die Histondemethylase JMJD1A einer sauerstoffabhängigen HIF-1-vermittelten Regulation unterliegt. Diese neu ge-wonnenen Erkenntnisse lassen ein direktes Zusammenwirken von HIF-1 und epigenetischen Regulationsmechanismen in der zellulären Adaptation auf Hypoxie vermuten, in der JMJD1A als direkter oder indirekter epigenetischer Vermittler von HIF-1 zu fungieren scheint. Erst die weitere Aufschlüsselung dieser komplexen Interaktionsmechanismen wird die Grundlage schaffen, neue therapeutische Strategien z.B. in der Onkologie und der regenerativen Medizin entwickeln zu können.

Hypoxia threatens the cell integrity of most organisms and affects cellular functions sustainably. As a reaction to hypoxia, the hypoxia-induced transcription factor-1 (HIF -1) mediates directly and indirectly a plethora of adaptation processes with the ultimate goal of cell survival. This includes among others modifications of chromatin structure and complex changes in gene expres-sion patterns. histone demethylase Jumonji domain containing 1A (JMJD1A) transactivates dis-tinct target genes by demethylation of H3K9 residues and thereby serves as a transcription modulator itself. The aim of this study was to examine the influence of hypoxia in general and the role of HIF-1 in particular on the expression of histone demethylase JMJD1A. Using the technique of quantitative RT-PCR, a significant increase of JMJD1A transcription could be detected under hypoxic compared to normoxic conditions in a variety of human cell lines and various human and murine tissues. Western blot studies showed that hypoxic induction is also reflected at protein level. Blocking HIF-1 signaling by specific siRNAs directed against HIF-1α mRNA in human endothelial cells revealed that HIF-1 is essential for the oxygen- dependent induction of JMJD1A. Via cloning numerous systematically shortened JMJD1A pro-moter constructs and specific mutations analysis, a single pivotal hypoxia responsive element (HRE) in the promoter of the human JMJD1A gene, located 1208bp upstream of the start codon, could be identified in reporter gene analysis that mediates JMJD1A upregulation by hypoxia. In summary, this research demonstrated for the first time, that the histone demethylase JMJD1A is subject to an oxygen-dependent HIF-1 mediated regulation. These new findings lead to the assumption of a direct interaction of HIF-1 and epigenetic regulation mechanisms in the cellular adaptation to hypoxia in which JMJD1A appears to be acting as a direct or indirect epigenetic mediator of HIF-1 signaling. Thus, the basis is established to develop new therapeutic strategies e.g. in oncology and regenerative medicine by further breakdown of these complex interaction mechanisms.