Identification of the key inflammatory cytokines on the regulation of the metastasis gene MACC1 in colorectal cancer

Abstract

Background Colorectal cancer (CRC) is the third most common malignancy and one of the main causes of cancer-related mortality. One of the crucial oncogenes involved in molecular pathogenesis of colorectal cancer is MACC1, which has been identified as a metastasis-associated gene. Moreover, MACC1 has been reported to be a prognostic biomarker for oncogenesis, metastasis formation and metastasis-free survival, inducing cell proliferation and migration in vitro and metastasis in CRC mouse models in vivo. Inflammation plays a pivotal role in tumorigenesis and tumor progression, and influences the metastatic process. Since certain cytokines, such as TNF- and IFN-, are key risk factors in determining the contribution of the inflammatory process to CRC, knowledge of the connection between inflammation and the effects of TNF- induction on MACC1 remains unclear. Methods The mRNA and protein expression of MACC1, with or without TNF- stimulation, was evaluated using RT-qPCR and Western blotting, respectively. The pre-established transcription factor c-Jun mutation was used to investigate the effects of MACC1 expression and cellular function following TNF- treatment. In the cell model used, the TNF- receptor responsible for MACC1 induction was determined by neutralizing antibodies. To investigate signal transduction from the receptor to the effector molecules, knockdown experiments were performed for key molecules of the NF-B signaling pathway. Results The expression of MACC1 and its transcription factor c-Jun were significantly increased in a dose-dependent manner following TNF- treatment. Importantly, knockdown of c-Jun using siRNA caused a marked reduction in both MACC1 and c-Jun expression following TNF- stimulation. TNF- promoted MACC1-induced cell migration and this phenotype was abolished following knock down of MACC1. Moreover, both MACC1 and c-Jun expression were downregulated by blocking TNFR1, but not TNFR2. Furthermore, knock down of the NF-B subunit, p65, reduced basal MACC1 and c-Jun mRNA expression levels. Conclusion The present study highlights the fact that TNF- regulates the induction of MACC1 via its transcription factor, c-Jun, to execute its function in CRC cells. The subunit of NF-B, p65, which is involved in the activity of c-Jun, further governs MACC1 induction. This finding may unravel a novel signaling pathway upstream of MACC1 and provide a potential therapeutic target for the treatment of CRC patients.

Einleitung Das kolorektale Karzinom ist die dritthäufigste Krebserkrankung und eine der Hauptursachen für die krebsbedingte Sterblichkeit. MACC1 wurde als metastasierungsassoziiertes Gen unter anderem im kolorektalen Karzinom identifiziert. Es ist eines der entscheidenden Onkogene für die molekulare Pathogenese dieser Entität. MACC1 ist ein prognostischer Biomarker für die Krebsentwicklung, die Metastasenbildung und das metastasenfreie Überleben. MACC1 induziert die Zellproliferation und –migration in vitro sowie die Metastasierung in vivo. In der Tumorentstehung und –progression spielen Entzündungsprozesse eine entscheidende Rolle. Daneben beeinflussen sie die Entstehung von Metastasen. Zytokine wie TNF-alpha und IFN-y sind Schlüsselfaktoren von Entzündungsprozessen im Allgemeinen und während der Entwicklung des kolorektalen Karzinoms im Speziellen. Der Zusammenhang von entzündlichen Prozessen und der MACC1 Expression ist nicht bekannt. Methoden Die MACC1mRNA-und Proteinexpression vor und nach Zytokinstimulation wurde mit Hilfe von RT-qPCR (mRNA) bzw. Western-Blot (Protein) bestimmt. Mit Hilfe von Expressionsanalysen, Promotor-Reporter und knockdown Experimenten wurde der Einfluss von Transkriptionsfaktoren auf die MACC1 Expression nach Zytokininduktion untersucht. Im verwendeten Zellmodell wurde durch neutralisierende Antikörper der für die MACC1-Induktion verantwortliche Rezeptor bestimmt. Um die Signalübertragung vom Rezeptor zu den Effektormolekülen zu untersuchen, wurden knockdown Experimente für Schlüsselmoleküle des NF-B Signalweges durchgeführt. Ergebnisse Die Expression von MACC1 und des für die MACC1 Expression wichtigen Transkriptionsfaktors c-Jun war nach TNF-alpha Behandlung dosisabhängig signifikant erhöht. IFN-y hatte nur einen geringen Effekt auf die MACC1 und c-Jun Expression. Der Knockdown von c-Jun mit Hilfe von siRNA führte zu einer deutlichen Verringerung sowohl der MACC1 als auch der c-Jun Expression nach TNF-alpha Stimulation. Die Stimulation mit TNF-alpha erhöhte die MACC1-induzierte Zellmigration. Dieser Phänotyp wurde den MACC1 knock down aufgehoben. Die Blockade des TNFR1 führte darüber hinaus zum Fehlen der MACC1und c-Jun Induktion durch TNF-alpha. Dieser Effekt wurde für TNFR2 nicht beobachtet. Der knock down von der NF-B Untereinheit p65 führte zu einer Reduktion des basalen MACC1 und c-Jun mRNA Expressionsniveaus. Schlussfolgerungen In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass TNF-alpha MACC1 über die Aktivierung von c-Jun induziert. Die NF-B Untereinheit p65, die ebenfalls an der Aktivierung von c-Jun beteiligt ist, reguliert auch die MACC1 Induktion durch TNF-alpha. Diese Ergebnisse beschreiben die Regulation von MACC1 durch externe Stimuli und zeigen neue Ansätze für die Krebstherapie vor allem der hoch-Risiko Patienten mit erhöhter MACC1 Expression.