Analyse der Immunantwort nach Infektion mit Gelbfieberviren

Abstract

Gelbfieber ist eine lang bekannte, impfpräventable Infektionskrankheit. Trotzdem ist nach wie vor unklar, welche Mechanismen zu einem lang anhaltenden Impfschutz führen und was die Gründe für das Zustandekommen von Impfzwischenfällen (YEL-AE) sind. Mit dieser Arbeit wurden wesentliche methodische Verbesserungen für zukünftige Studien der Immunantwort erarbeitet. Mit der TaqMan-PCR ist eine Quantifizierung von YFV und von YFV- infektionsbedingter Genexpression in infizierten Proben (Serum, Gewebe) mit hoher Genauigkeit möglich. Als Referenzgenkandidaten wurden drei Gene ermittelt (L13, TBP und PPI), die in den YFV-relevanten Gewebe oder Zellen im Gegensatz zum bisherigen Referenzgen ?-Aktin konstitutiv exprimiert werden. Der Zytokin Array erlaubt im Vergleich zu allen anderen Methoden die kostengünstige, schnelle, umfassende und semiquantitative Bestimmung der Zytokine. Der Primerset zur Ermittlung der Sequenzen in den variablen Bereichen erlaubt die schnelle Charakterisierung der Virusstämme in mit oder ohne Komplikationen Geimpften, so dass Virusmutationen als Ursache für Komplikationen ausgeschlossen werden können. Mit diesen etablierten und verbesserten Methoden wurden Gelbfiebervirus (YFV)-Infektionen nach Impfung und nach Wildtypinfektion näher untersucht. Aus der vergleichenden Analyse der Immunantwort von YFV-Wildtypinfizierten (YFVInf), YFV-geimpften Personen (Impflinge) und YFV-Impfzwischenfällen (YEL-AE) konnten so einige neue Erkenntnisse bezüglich der durch YFV induzierten Immunantwort gewonnen werden. Die klinischen Daten, der Virustiter und die neutralisierenden Antikörper von YFVInf und YEL-AEs zeigen, dass Personen mit YFVInf und viszerotrope Impfzwischenfälle (YEL-AVD) mit fatalem Ausgang (YEL-AVDFat) ein sehr ähnliches Bild aufweisen und kaum voneinander zu unterscheiden sind. YEL-AEs mit nichtfatalem Ausgang schwanken in ihrer Manifestation. Eine Rückmutation des Impf- zum Wildtypvirus kann auf Grund der hier durchgeführten Sequenzanalysen als Ursache für YEL-AEs ausgeschlossen werden. Somit ist der Fokus weitergehender Untersuchungen auf die Wirtsfaktoren zu legen. Als ein wirtsspezifischer Faktor wurde im weiteren Verlauf der Arbeit ein Teilaspekt der zellulären Immunantwort betrachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der Immunantwort durch die YFV-Infektion hinsichtlich der Zytokine sowohl in den Impflingen als auch in den YELAEs im Vergleich zu den YFVInf deutlich geringer ausfällt. Die Anzahl der Zytokine und die Stärke der Zytokinausschüttung sind bei den YEL-AEs deutlich ausgeprägter als in den Impflingen und könnten mit dem Schweregrad der Nebenwirkungen zusammenhängen. Dabei könnten die Zytokine IL-6, IL-8, GRO, MIG, MCP-1, TGF-?1, TNF-? und RANTES eine große Rolle spielen. Bei dem YEL-AVDFat waren die gleichen Zytokine (IL-6, IL-8 und MCP-1) stark erhöht, wie dies auch bei den YFVInf der Fall ist. Außerdem konnten GRO und MIG in hohen Konzentrationen bei dem YEL- AVDFat nachgewiesen werden. Personen ohne Impfbeschwerden zeigten in den Zytokinmessungen auf Proteinebene nur eine deutliche Reaktivität von RANTES, während andere Zytokine kaum oder gar nicht nachzuweisen waren. Des Weiteren wurden drei Mutationsstellen im E-Protein des attenuierten YFV 17D untersucht, die im Verdacht stehen, für die Abschwächung des Gelbfiebervirus (YFV) zu sorgen. Das E-Protein steht im Verdacht, für die Virulenz verantwortlich zu sein. Acht Aminosäuren des E-Proteins erscheinen besonders interessant. Drei der acht Aminosäuren wurden für anschließende Mutationsstudien verändert, um einen Aufschluss über die molekularen Determinanten der Attenuierung zu bekommen. Die Substitutionsmutanten pMutE52 und pMutE200 zeigten gegenüber dem Wildtyp und dem Impfstoffstamm eine ähnliche Replikationsfähigkeit, während pMutE299 nicht in Zellkultur replizieren konnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Befunde, dass vor allem die zelluläre Immunantwort nach YFV- Infektion bzw. Impfung deutliche diagnostische Hinweise über den Verlauf der Impfung bzw. Infektion ergeben. Die Immunantwort und die Erstinfektion von Körperzellen durch YFV bedarf dringend weiterer Untersuchungen, um klare Antworten auf die Erzeugung einer protektiven Immunantwort geben zu können. Ohne eine Antwort auf diese Frage ist eine Aufklärung der schweren Fälle von Nebenwirkungen bzw. Todesfällen nach YFV-Impfung nahezu unmöglich. Um die Ursachen der Attenuierung der Impfstämme von YFV aufzuklären, sind weitere vergleichende Studien mittels reverser Genetik sowie auch alternative Methoden zur Messung der viralen Fitness (Replikationsfähigkeit, Infektiosität) notwendig, um den genauen molekularen Mechanismus der phänotypischen Effekte zu klären.

Yellow Fever 17D vaccine is one of the oldest and most successful vaccines ever developed and belongs to the most important vaccines in prevention of serious Yellow Fever (YF) in Africa and South America. The various mechanisms of a protective immune response against the Yellow Fever Virus (YFV) infection and the outcome of Yellow fever adverse events (YEL-AE) are still widely unknown. In this study essential methodological improvements concerning future studies on immune response were elaborated. The developed TaqMan-PCR allows a quantification of YFV and YFV-infection related gene expression in infected samples (serum, tissue) with high accuracy. Three genes (L13, TBP, PPI) were determined as reference genes, which are in contrast to ?-actin constitutively expressed in YFV infected cells and tissue. The cytokine array permits in comparison to other methods a cost-efficient, rapid, broad, and semi- quantitative determination of cytokines. The set of primers for sequence analysis of highly variable regions within the YFV genome allows a fast characterization of virus strains in vaccinated persons with or without side effects, so that virus mutations could be excluded as cause of complications. With these established and improved methods YFV infections after vaccination and after wild type infection could be examined. From the comparative analysis of the immune response of YFV-wild type infected (YFVInf), YFV vaccinated (vaccinees) and YFV adverse events (YEL-AE) new insights regarding YFV induced immune response could be achieved. The clinical data, the virus titer as well as the neutralizing antibodies of YFVInf and YEL-AE indicate that persons with YFV infection and YFV viscerotropic adverse events (YEL-AVD) with fatal outcome (YEL-AVDFat) show a very similar image and are hardly differentiated. YEL-AE with non fatal outcome vary in their manifestations. A reverse mutation from vaccine to wild type strain can be excluded as cause for YEL-AE due to the here performed sequence analysis. Therefore the focus for future studies should be laid on host factors. In this study a partial issue of the cellular immune response was investigated as a host specific factor. It could be shown that the activation of the immune response by YFV-infection regarding the cytokines is lower as well in the vaccinees as in YEL-AE than in YFVinf. The number of the cytokines and the amount of their release are considerably stronger in YEL-AE than in vaccinees. This could be linked with the severity of side effects. Thereby the cytokines IL-6, IL-8, GRO, MIG, MCP-1, TGF-?1, TNF-? und RANTES could play a major role. In the YEL-AVDFat the same cytokines (IL-6, IL-8, MCP-1) were highly elevated as well as in YFVInf. GRO and MIG could also be measured in high concentrations in YEL-AVDFat. In the measurement of cytokines on protein level, persons without side effects showed only a high reactivity for RANTES, while other cytokines were only rarely or not detectable. Furthermore three mutation sites were analyzed in the E-protein region of the YFV-17D vaccine strain, which are suspected to be the reasons for the attenuation of YFV. The E-protein is supposed to be responsible for the virulence. Eight amino acids of the E-protein seem to be very interesting targets. Three of them were changed for mutation studies to get insights about the molecular determinants of the attenuation. The substitution mutants pMutE52 and pMutE200 showed in contrast to the wild type and the vaccine strain a similar replication efficiency while pMutE299 could not replicate in cell culture. The results of this study support the findings, that especially the cellular immune response after YFV infection and vaccination give a clear diagnostically indication regarding the course of infection and vaccination, respectively. The immune response as well the primary infection of cells by YFV needs further investigations to clarify the activation of a protective immune response. This will help to find out details regarding the mechanism which could conduct to severe cases with side effects and deaths after YFV vaccination. To elucidate the causes of attenuation of YFV vaccination strains further comparative studies by reverse genetics as well as by alternative methods for the detection of viral fitness (replication efficiency, infectivity) are necessary to understand the specific molecular mechanism of the phenotypic effects.