Feinkartierung und Identifizierung eines neuen Kandidatengens im Albuminurie-QTL auf Rattenchromosom 6 der MWF-Ratte

Abstract

Einleitung: Die Albuminurie (UAlb) gilt als bedeutender, unabhängiger Risikofaktor für die Entwicklung kardio- und zerebrovaskulärer Ereignisse sowie einer progressiven Nephropathie und unterliegt einer komplexen multifaktoriellen Pathogenese unter Beteiligung genetischer Faktoren. Die Munich Wistar Frömter (MWF)-Ratte zeichnet sich durch eine frühzeitig spontan einsetzende UAlb aus und hat sich als Tiermodell für die Identifikation einzelner, kausal an der UAlb beteiligter Gene bewährt. Durch die gezielte Verpaarung von MWF mit dem kontrastierenden, nierengesunden Stamm SHR (Spontan Hypertensive-Ratte) und umfangreicher genetischer Analysen konnte auf Rattenchromosom (RNO)6 ein wichtiger Quantitative Trait Locus (QTL), UAlb1-QTL, für die UAlb-Entwicklung identifiziert werden. Durch den Transfer des UAlb1-QTL aus SHR in den isogenetischen Hintergrund von MWF konnte die kongene Tierlinie MWF.SHR-(D6Rat1-D6Mgh4) etabliert werden, welche im Alter von 8 Wochen eine gegenüber MWF um 91% supprimierte UAlb zeigt. Ziel der vorliegenden Arbeit waren die Validierung des UAlb1-QTL für die progressive UAlb-Entwicklung im weiteren Altersverlauf im Tiermodell sowie die molekulargenetische Analyse des innerhalb des UAlb1-QTL kartierenden Gens Transmembranprotein 63c (Tmem63c) als potentielles, neuartiges Kandidatengen für die UAlb mit bislang unbekannter Relevanz für Nierenerkrankungen. Methodik: Die Bestimmung der UAlb im 24h-Sammelurin erfolgte mittels rattenspezifischem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bei 14 und 24 Wochen alten Tieren. Blutdruckabhängige Effekte auf die UAlb wurden mittels invasiver und nicht-invasiver Blutdruckmessung zum Zeitpunkt der 14. Woche erfasst. Die Analysen des Kandidatengens Tmem63c umfassten differentielle Genexpressionsanalysen mittels quantitativer Real Time-PCR (RT-qPCR), Western Blots an Glomeruli-Isolaten und immunhistochemische Untersuchungen an Paraffinschnitten ganzer Nieren bei 4, 8, und 24 Wochen alten Tieren. Ergebnisse: Der Transfer des UAlb1-QTL aus SHR in MWF resultierte beim kongenen Stamm MWF.SHR-(D6Rat1-D6Mgh4) gegenüber MWF in einer signifikanten Reduktion der UAlb um 89% in der 14. Woche und um 68% in der 24. Woche (p<0,0001). Zusätzliche blutdruckabhängige Effekte auf die Suppression der UAlb konnten ausgeschlossen werden. Expressionsanalysen des Gens Tmem63c zeigten zu allen Zeitpunkten ein differentes, allelisch reguliertes Expressionsmuster mit einer gegenüber den nierengesunden Stämmen SHR und MWF.SHR-(D6Rat1-D6Mgh4) signifikanten Hochregulation der Tmem63c mRNA-Expression beim albuminurischen MWF-Stamm (p<0,001). Mittels Western Blot konnte die Expression des Proteins TMEM63C in den Glomeruli nachgewiesen werden. Immunhistochemisch dominierte zu allen Zeitpunkten eine Expression des Proteins TMEM63C in den glomerulären Podozyten sowie eine im Altersverlauf zunehmende Expression im Bürstensaum proximaler Tubuli. Schlussfolgerung: Der UAlb1-QTL auf RNO6 ist von erheblicher Relevanz für die Prävention einer progressiven UAlb. Das im UAlb1-QTL kartierte Gen Tmem63c stellt ein vielversprechendes, neuartiges Kandidatengen für die UAlb dar, dessen pathophysiologische Bedeutung in weiterführenden Studien im Detail zu untersuchen ist.

Background: Albuminuria (UAlb) is an independent risk factor for the development of chronic nephropathy and cardio- or cerebrovascular events in the general population. However, due to the complexity of this phenotype, identification of single causative genetic factors of UAlb is still limited. The Munich Wistar Frömter (MWF) rat represents a model for chronic kidney disease with the development of severe UAlb. By genomic analysis in MWF and normoalbuminuric SHR (spontaneously hypertensive rat) an important quantitative trait locus (QTL) with significant linkage to UAlb was identified on rat chromosome (RNO)6 and termed UAlb1-QTL. By intogressing the UAlb1-QTL from SHR into the isogenetic background of MWF the congenic strain MWF.SHR-(D6Rat1-D6Mgh4) could be established, which showes at the age of 8 weeks a signficant 91% reduction of UAlb. Within the UAlb1-QTL a novel putative candidate gene for UAlb, i.e. transmembrane protein 63c (Tmem63c), was identified. In this study, the impact of the UAlb1-QTL on the progressive development of UAlb and the potential role of Tmem63c as a novel putative candidate gene should be validated. Methods: UAlb was analysed with a rat-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-technique in 24h-urine in 14 and 24 week old animals. Blood pressure was measured either by intra-arterial and non-invasive tail-cuff measurements at 14 weeks of age. Glomeruli of the kidney were isolated and RNA and protein were extracted. Differentially mRNA expression and protein levels of Tmem63c were investigated by Real-time PCR (RT-qPCR) and western blot analysis at week 4, 8 and 24. In addition, immunohistochemisty analysis in paraffin sections of the whole kidney was performed. Results: Introgressing the UAlb1-QTL from SHR into MWF resulted in a significant decrease in UAlb of about 89% at week 14 and 68% at week 24 compared to MWF (p<0.0001). Blood pressure effects as a causative role of the observed differences on UAlb could be excluded. Expression analyses of Tmem63c revealed significant increase in albuminuric MWF compared to SHR and MWF.SHR-(D6Rat1-D6Mgh4) (p<0.001, each timepoint). Western blot analyses validated successfully translation of Tmem63c into protein in glomeruli samples. Immunohistochemistry showed strong expression of TMEM63C in glomerular podocytes. Furthermore, progressive staining was also observed in the brush order of the proximal tubulus. Conclusion: The identified UAlb1-QTL on RNO6 provides a protective effect in the development and progression of UAlb, when exchanged in MWF. Findings on Tmem63c indicate a potential causative role for the development of an albuminuric phenotype in the MWF model and support further translational research on its role for the development of chronic kidney disease.