Einfluss der Interleukin-1β-Kurzzeitstimulation humaner mesenchymaler Stammzellen in Ko-Kulturen mit Osteosarkomzellen

Abstract

Einleitung: Ausgedehnte Knochendefekte mit eingeschränkter Wundheilung, die durch Frakturen oder infekt- sowie tumorassoziierten Resektionen verursacht werden, stellen im klinischen Alltag eine therapeutische Herausforderung dar, wenn konventionelle Behandlungsmaßnahmen an ihre Grenzen stoßen. Neue Behandlungsansätze haben das Ziel, die osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stromazellen (hMSCs) als fundamentalen Bestandteil der Knochenheilung zu unterstützen bzw. diese gezielt zu stimulieren. Neben der Stammzellendifferenzierung rückt die Beeinflussung umliegender Zellen durch parakrine Sekretion vermehrt in den Fokus. Interleukin-1β (IL-1β) wird als ein proinflammatorisches Zytokin in der Frühphase der Frakturheilung vermehrt exprimiert und mit der osteogenen Differenzierung von Stammzellen in Verbindung gebracht. Das Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss der IL-1β-Stimulation auf die Differenzierung humaner MSCs zu untersuchen sowie die Auswirkung dieser Differenzierung auf ko-kultivierte Osteosarkomzellen zu analysieren. Methodik: HMSCs von drei Spendern wurden in unabhängigen Experimenten für zwei Stunden mit 10 ng/ml IL-1β inkubiert und anschließend mit Osteosarkomzellen der MG-63-GFP-Zelllinie in einem Transwellverfahren ko-kultiviert. Die Kultivierung erfolgte für 28 Tage in Kontrolloder Differenzierungsmedium. Zur Untersuchung genetischer und funktioneller Auswirkungen wurden im Verlauf mRNA-Expression, DNA-Gehalt, Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) sowie die Kalziumaufnahme der Extrazellulärmatrix bestimmt. Ergebnisse: Durch die Stimulation humaner MSCs und Kultivierung in Differenzierungsmedium konnten deutliche Anzeichen einer osteogenen Differenzierung nachgewiesen werden. Die einsetzende Differenzierung der humanen MSCs führte zudem zu einer Beeinträchtigung, das Differenzierungsverhalten ko-kultivierter MG-63-GFP-Zellen zu beeinflussen. Durch die Kultivierung stimulierter hMSCs in Kontrollmedium resultierte hingegen ein eher regulierender Einfluss auf ko-kultivierte MG-63-GFP-Zellen, welche in der Folge eine Hochregulation osteogen-spezifischer Gene sowie eine erhöhte ALP-Aktivität ihrerseits zeigten. Schlussfolgerung: Eine zweistündige IL-1β-Stimulation humaner MSCs führt in Abhängigkeit vom Kulturmedium zu einer veränderten Zelldifferenzierung sowie zu einer Beeinflussung des Differenzierungsverhaltens ko-kultivierter MG-63-GFP-Zellen. Diese Erkenntnis bietet neue Möglichkeiten im Rahmen zukünftiger klinischer intraoperativer Zelltherapiekonzepte.

Abstract Introduction: Impaired bone healing in bones with critical size defects due to open bone fracture as well as infect- or tumor-associated surgery, are challenging the current therapeutic regimes. New treatment approaches target to accelerate bone healing by enhanced osteogenic differentiation of human mesenchymal stromal cells (hMSCs). Besides the aim to direct the stem cell differentiation, the interference of the surrounding cell environment by paracrine signalling is currently gaining interest. Interleukin-1β (IL-1) – a proinflammatory cytokine, which is highly expressed in the early fracture-healing phase – has been attributed to exert significant impact on the differentiation behaviour of hMSCs. Here, we investigated the effect of a 2-hour stimulation with Interleukin-1β. We aimed to analyse the differentiation and paracrine activity of bone marrow derived hMSCs in co-culture with MG-63- cells in vitro. Methods: HMSCs from three donors were incubated for 2 hours with 10ng/ml IL-1β in vitro and subsequently co-cultured with osteosarcoma cells (MG-63-GFP cell line) in a transwell system during independent experiments. Cells were either cultured in control medium or differentiation medium for 28 days. Genetic and functional effects were investigated by analysing mRNA gene expression, DNA content, alkaline phosphatase enzyme activity (ALP), Alizarin Red S staining and quantification and the Calcium-45 incorporation of the extracellular matrix. Results: Stimulated hMSCs cultured in control medium exhibited a more regulatory effect on cocultured MG-63-GFP cells leading to an up-regulation in osteogenic genes in combination with increased ALP activity. While stimulated hMSCs cultured under differentiation conditions exhibit signs of osteogenic differentiation, stimulation also caused an impaired stimulatory effect on the co-cultured MG-63-GFP cells. Conclusion: This data has demonstrated that a short, clinically relevant, 2-hour stimulation of hMSCs has the potential to modify their long-term behaviour and offers a novel approach for clinical cell therapy protocols. In addition, we were able to show, that advancing the osteogenic differentiation of hMSCs is affiliated with a loss in regulatory function when co-cultured with MG-63-GFP cells. These results reveal the potential value of stimulated hMSCs in an intraoperative setting.