EGCG directly targets intracellular amyloid-β(1-42) aggregates and promotes their lysosomal degradation

Abstract

Introduction: Several lines of evidence indicate that aggregation and accumulation of amyloid-β(1-42) (Aβ42) causes cellular dysfunction and toxicity. Besides extracellular Aβ42 plaque formation and the intraneuronal deposition of hyperphosphorylated tau protein in Alzheimer’s disease (AD) patient brains, intracellular Aβ42 aggregation plays an important role in AD pathogenesis and even precedes extracellular Aβ42 plaque formation. The fact that neuronal cells internalize secreted Aβ42 whereby intracellular Aβ42 aggregation is induced by a prion-like seeding process, has further highlighted the importance of intraneuronal Aβ42 aggregation in disease progression. A potential causal therapy of AD involves slowing disease progression by targeting seeding-competent intracellular Aβ42 aggregates and enhancing their degradation in neuronal cells.

Method: Therefore, a cell-based screening assay was established that allows the identification of small molecules effectively promoting the degradation of endocytotically internalized Aβ42 aggregates. This cell-based assay was intensively characterized and used in a proof-of-principle approach to screen a focused library of polyphenolic compounds preselected based on their anti-amyloidogenic properties in vitro. Further, atomic force, electron and confocal microscopy, biochemical analysis and enzyme activity assays were used and structure-activity relationship studies were performed to elucidate the mechanisms underlying the promotion of cellular aggregate degradation by direct amyloid-targeting compounds.

Results: The polyphenol epigallocatechin gallate (EGCG) most potently promoted the clearance of intracellular Aβ42 aggregates in the neuroblastoma cell model. As a consequence of EGCG treatment, intracellular Aβ42 aggregate load is reduced, Aβ42 seeding-activity of cellular extracts is mitigated and Aβ42-induced mitochondrial metabolic impairment is rescued in neuroblastoma cells as well in primary neurons. Mechanistic studies revealed that EGCG directly targets intracellular Aβ42 aggregates and that the EGCG-mediated increase in Aβ42 degradation is primarily dependent on lysosomal enzyme activity. Furthermore, EGCG-induced structural remodeling of fibrillar Aβ42 aggregates into amorphous subspecies showed to enhance lysosomal enzymatic cleavage by the cysteine-protease cathepsin B (CatB), presenting a potential mechanism for the strong increase of cellular Aβ42 aggregate degradation.

Take home points: Thus, this study shows that the direct targeting of intracellular Aβ42 aggregates with amyloid-remodeling compounds can be a promising approach to promote the degradation of proteotoxic peptide species. This can be an effective strategy to support the endogenous autophago-lysosomal degradation of intracellularly accumulating proteins in neurodegenerative proteinopathies such as amyotrophic lateral sclerosis, Huntington’s, Parkinson’s and Alzheimer’s disease.

Einleitung: Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Aggregation und Akkumulation von Amyloid-β(1-42) (Aβ42) eine zelluläre Dysfunktion und Zelltoxizität zur Folge haben. Neben der Entstehung von extrazellulären Aβ42 Plaques und der intrazellulären Ablagerung von hyperphosphorylierten Tau Proteinen im neuronalen Gewebe von Alzheimer Patienten, spielt die intrazelluläre Ablagerung von Aβ42 Aggregaten eine zentrale Rolle in der Pathogenese der Alzheimer-Demenz (AD) und geht der extrazellulären Plaque-Bildung sogar voraus. Die Erkenntnis, dass neuronale Zellen sekretiertes Aβ42 aufnehmen und dadurch eine intrazelluläre Fehlfaltung in einem Prionen-ähnlichen Seeding-Prozess induziert werden kann, lässt der intraneuronalen Aβ42 Ablagerung in der molekularen Pathogenese der Krankheitsprogression eine besondere Wichtigkeit zukommen.

Methodik: Aufgrund dessen haben wir ein zellbasiertes Testverfahren entwickelt, mit dem niedermolekulare Substanzen identifiziert werden können, welche den Abbau von endozytotisch internalisierten, seeding-kompetenten Aβ42 Aggregaten fördern. Mittels diesem zellbasierten Screeningverfahren haben wir eine fokussierte Bibliothek aus Polyphenol-Verbindungen getestet, die aufgrund ihrer bekannten, anti-amyloidogenen Wirkung vorselektiert wurden. Darüber hinaus wurden Rasterkraft-, Elektronen- und Konfokalmikroskopie sowie biochemische Proteinanalyse- und Enzymaktivitätsverfahren verwendet, um den zugrundeliegenden Mechanismus der Förderung des Abbaus von intrazellulären Proteinaggregatspezies durch anti-amyloidogene, niedermolekulare Substanzen aufzuklären.

Ergebnisse: Das Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG) zeigte die potenteste Wirkung auf die Reduktion von intrazellulären Aβ42 Aggregaten in unserem Modellsystem. Durch die EGCG-Behandlung wird die Menge an intrazellulären Aβ42 Aggregaten stark reduziert, die Seeding-Kapazität zellulärer Extrakte abgeschwächt und der durch Aβ42 induzierten verminderten mitochondrialen Stoffwechselaktivität sowohl in Neuroblastoma-Zellen als auch in primären Neuronen entgegengewirkt. Mechanistische Untersuchungen offenbarten zudem, dass EGCG direkt an intrazellulären Aβ42 Aggregaten ansetzt, dass die Abbau-fördernde Wirkung abhängig von der lysosomalen Enzymaktivität ist und, dass die durch EGCG bewirkte, strukturelle Umlagerung von fibrillären Aggregaten in amorphe Subspezies den Aβ42 Abbau durch das lysosomale Enzym Cathepsin B erleichtert.

Fazit: Diese experimentellen Arbeiten zeigen somit, dass Amyloidstruktur-verändernde, niedermolekulare Substanzen, die direkt an intrazelluläre Aβ42 Aggregate binden, einen vielversprechenden Ansatz zur Reduktion der intrazellulären Aβ42 Last darstellen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um bei proteinopathischen neurodegenerativen Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose, Chorea Huntington, Parkinson und der Alzheimer Erkrankung die zelleigene Verstoffwechslung von fehlgefalteten, intrazellulär-akkumulierenden Proteinen im lysosomalen Kompartiment zu stärken.