Der Einfluss einer prolongierten Interleukin-4-Behandlung auf Inflammation, Matrixdegradationssystem und linksventrikuläre Funktion im Myokarditis- Mausmodell

Abstract

In pathogenetischer Hinsicht zeigt die murine CVB3-Myokarditis einen dreiphasigen Verlauf: eine akute Phase der viralen Infektion, eine subakute Phase der Immunantwort und eine chronische Phase des Myokardumbaus und der Dilatation. Der Ausgang der Myokarditis wird bestimmt von Art und Umfang der entzündlichen Reaktion und dem Umbau der extrazellulären Matrix (EZM). Die vorliegende Arbeit sollte zur Charakterisierung der entzündlichen Reaktion, des matrixregulierenden Systems und der kardialen Funktionsstörung bei SWR/J-Mäusen mit CVB3-Myokarditis beitragen. In einem zweiten Abschnitt sollte das Verhalten der gleichen Parameter unter einer Immunmodulation mit exogen zugeführtem Interleukin-4 (Il-4) untersucht werden. In die Studie wurden 24 acht Wochen alte, männliche SWR/J-Mäuse aufgenommen. Sechs Tiere dienten als Kontrollen, sechs Tiere wurden mit 5 x 105 plaque forming units (PFU) CVB3 (Nancy strain) i.p. infiziert, sechs Tiere dienten als Behandlungskontrollen und wurden mit 200 ng/die rekombinantem murinem Interleukin-4 (rmIl-4) i.p. über 14 Tage behandelt und sechs Tiere wurden gleichzeitig infiziert und mit rmIl-4 behandelt. Am Ende der Studie 14 Tage p.i. wurden alle Tiere nach Messung der Hämodynamik (Herzfrequenz, LVESP, dP/dtmax, dP/dtmin) getötet und das Herz für weitere Untersuchungen entnommen. Die Entzündungsreaktion wurde durch Messung der mRNA-Expression von Il-1[beta], TNF-[alpha], IFN-[gamma], Il-6 und Il-10 mittels semiquantitativer RT-PCR sowie durch immunhistochemische Bestimmung der CD3+-T-Lymphozyten bzw. CD11b+-Makrophagen untersucht. Der Zustand des matrixregulierenden Systems wurde durch Bestimmung der mRNA-Expression von MMP-2, MMP-3, MMP-9, MT1-MMP, TIMP-4, uPA und tPA sowie durch die zymographische Messung der Aktivität von MMP-2 analysiert. Etwaige Veränderungen des Kollagengerüstes wurden mittels der Messung der mRNA-Expression von Kollagen Typ I (Kol I) und Typ III (Kol III) überprüft. Zur Frage der Auswirkungen der Immunmodulation wurden alle Parameter der unbehandelten infizierten Tiere mit denen der behandelten infizierten Tiere verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die infizierten SWR/J-Mäuse gegenüber den Kontrollen eine starke entzündliche Reaktion mit Zytokinexpression und CD3+-Zellinfiltration aufwiesen. In Bezug auf das Zytokinmuster dominierte die proinflammatorische Th1-Immunantwort. Gleichzeitig bestand eine Aktivierung des matrixdegradierenden Systems mit einem Anstieg von MMP-3, MMP-3/TIMP-4, uPA und der MMP-2-Aktivität, jedoch ohne Auswirkungen auf die Kol I- oder Kol III-Expression. Alle hämodynamischen Parameter waren im Sinne einer schweren kardialen Dysfunktion verändert. Die mit Il-4 behandelten infizierten Tiere zeigten gegenüber den unbehandelten infizierten Tieren eine Reduktion der entzündlichen Reaktion (proinflammatorische Zytokine und CD3+-Zellen) eine Umkehr der matrixregulierenden Parameter (Abfall von MMP-3, MMP/TIMP- Quotienten, MMP-2-Aktivität und uPA) sowie eine unveränderte Kol I-/Kol III- Expression. Aus den Daten kann abgeleitet werden, dass durch eine langfristige Immunmodulation mit Il-4 eine wesentliche kardiale Funktionsabnahme bis zum Ende der subakuten Phase der CVB3-Myokarditis verhindert werden kann. Ursächlich scheinen hieran sowohl eine Suppression der inflammatorischen Reaktion als auch eine Umkehr der MMP/TIMP-Dysbalance beteiligt zu sein. Die unveränderte Kol I-/Kol III-Expression weist darauf hin, dass bei SWR/J-Mäusen zu diesem Zeitpunkt des Myokarditisverlaufes noch keine quantitativen Veränderungen des Kollagengerüstes vorliegen, was aber qualitative Veränderungen wie z.B. Auflösung von Quervernetzungen nicht ausschließt.

The pathogenesis of murine coxsackie virus B3 (CVB3)-induced myocarditis is characterized by three consecutive phases: The acute phase following virus- inoculation exhibits virus-induced cytotoxicity, the subacute phase is characterized by an activation of the immune system and the chronic phase is dominated by myocardial remodeling and left ventricular dysfunction. The outcome depends on the severity of the inflammatory response and the extent of the extracellular matrix remodeling. The purpose of this study was to establish and to characterize a CVB3-induced experimental myocarditis in SWR/J mice. In a second step, the impact of an immune modulation by interleukin-4 (Il-4) on inflammatory reaction, matrix regulating system and cardiac dysfunction was studied. Twenty four eight week old male SWR/J mice were included. Six sham-infected mice and six mice infected with 5x105 PFU CVB3 (Nancy strain) intraperitoneally served as baseline for characterizing viral myocarditis. Additional six sham-infected and six CVB3 infected mice were treated continuously with 200ng/d rm-IL-4 for 14 days to study the effects of an immune modulation by rm-IL-4. At the end of the study, 14 days post- infection (p.i.) left ventricular function (heart rate, LVESP, dP/dtmax, dP/dtmin, cardiac output and ejection fraction) was investigated by cardiac catheterisation using a conductance micromanometer system. Afterwards all mice were sacrificed. Myocardial samples were obtained and studied for inflammatory reaction by measurement of mRNA expression of different cytokines (IL-1[beta], TNF-[alpha], INF-[gamma], IL-6, and IL-10, respectively) by semiquantitative RT-PCR. Immunohistochemical staining was used to analyse the infiltration with CD3+-T-lymphocytes and CD11b+-cells. Alterations in the matrix regulating system were studied by mRNA expression analysis of MMP-2, MMP-3, MMP-9, MT1-MMP, TIMP-4, urokinase plasminogen activator (uPA), and tissue type plasminogen activator (tPA), respectively. In addition, MMP-2 activity was measured by gelatin zymography. With regard to changes in the collagen network mRNA expression of collagen type I (Col I) and collagen type III (Col III) was studied. On day 14 p.i., non-treated infected mice showed significantly increased infiltration with CD3+-T-lymphocytes and a dominating expression of proinflammatory Th1-cytokines. The mRNA expression of MMP-3 and uPA, the MMP-3 / TIMP-4 ratio as well as the MMP-2 activity were increased pointing to a dysbalance in the MMP / TIMP system. However, the myocardial mRNA expression of Col I and Col III was unchanged. These biochemical alterations were accompanied by a severe left ventricular dysfunction. In contrast to the non- treated mice, the IL-4-treated infected mice showed a significant reduction in inflammatory infiltrates and proinflammatory cytokine expression, a balanced MMP / TIMP system and, most importantly, an almost unchanged left ventricular function. Continuous treatment by IL-4 in murine CVB3-induced myocarditis may prevent from cardiac dysfunction at the end of the subacute phase by suppression of the inflammatory response and stabilisation of the MMP / TIMP system. The unchanged overall mRNA expression of Col I and Col III in untreated as well as treated mice doesn’t exclude alterations in the collagen network such as a reduction in the collagen cross-linking as described by others.