Molekularbiologische Untersuchungen zum Nachweis, zur Epidemiologie und zur Differenzierung aviärer Pockenviren

Abstract

Als Ziel der vorliegenden Arbeit wurde eine Polymerasekettenreaktion (PCR) als molekularbiologisches System zum routinemäßigen Nachweis und zur Differenzierung aviärer Pockenviren etabliert. Durch Untersuchungen von Hühnerpockenimpfstoff (HP-B) und Probenmaterial, in dem mittels konventioneller Diagnostikverfahren Geflügel-pockenvirus nachgewiesen worden war, wurde dieses Nachweisverfahren hinsichtlich seiner Spezifität überprüft. Es zeigte sich, dass hühnerpockenvirus-spezifische DNA nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte eindeutig durch eine Bande von 578 bp nachgewiesen werden konnte. Die Untersuchungen anderer aviärer Viren führten hingegen zu negativen Ergebnissen. Die Bestimmung der Sensitivität erfolgte mittels Auftrennung der PCR-Produkte durch Gelelektrophorese. Hühnerpockenvirus-spezifische DNA konnte ab einer Menge von 150 Genomäquivalenten nachgewiesen werden. Im Vergleich wurde die Sensitivität auch mittels Dot Blot-Verfahren überprüft. Hier zeigte sich eine Nachweisgrenze ab 75 Genomäquivalenten. Die Sensitivität des etablierten Verfahrens mit Gelelektrophorese der PCR-Produkte erscheint jedoch ausreichend, und durch die einfache sowie schnellere Anwendung vorteilhaft für die Routinediagnostik zu sein. Anhand der etablierten PCR und des im Rahmen der Geflügelpockendiagnostik von 2001 bis 2003 eingesandten Probenmaterials wurden Pockenvirusinfektionen in Geflügelbeständen unter epidemiologischen Gesichtspunkten untersucht. Es konnte am Anfang des Untersuchungszeitpunktes ein deutlicher Anstieg an Geflügel-pockeninfektionen beobachtet werden, der im Zusammenspiel mit weiteren Faktoren, insbesondere in der Einstellung der prophylaktischen Pockenimpfung in den letzten 20 Jahren, begründet sein könnte. Seit dem Jahr 2002 zeigte sich bei erneuter Intensivierung der Impfung eine wieder abnehmende Tendenz an Infektionen. Des Weiteren wurde die PCR in Kombination mit der Restriktionsenzymanalyse (REA) als ein molekularbiologisches System zur Differenzierung verschiedener Avipockenvirusspezies verwandt. Unter Verwendung eines Primerpaares konnte mittels PCR avipockenvirus-spezifische DNA in 53 Avipockenvirusstämmen und -isolaten von zwölf Vogelarten aus acht Ordnungen nachgewiesen werden. Mittels REA unter Verwendung der Enzyme EcoRV und NlaIII konnten die acht Ordnungen der verschiedenen Vogelarten weitgehend sechs spezifischen Spaltbildern zugeordnet werden. Die Stämme und Isolate von Hühnern sowie Puten (Ordnung Phasianiformes), Tauben und Strauß (Ordnungen Columbiformes und Struthioniformes), Falken (Ordnung Falconiformes) und Agaporniden (Ordnung Psittaciformes) führten jeweils zu einem spezifischen Spaltbild. Schwierigkeiten zeigten sich nur bei Isolaten von Vogelarten der Ordnung Passeriformes. Während die Isolate einer Rabenkrähe, eines Hakengimpels und von drei Kanarienvögeln sowie zwei Sperlingen zu einem Sperlingsvögel -spezifischen Spaltbild führten, zeigten sich zwei Abweichungen: bei Untersuchung der Kanarienpockenvirus-Stämme KP-1-V557 und KP-1 sowie eines Kanarienvogelisolates ergab sich durch eine zusätzliche EcoRV-Spaltstelle ein weiteres Spaltbild, und die Untersuchung von zwei Sperlingsisolaten führten zu dem Spaltbild, welches spezifisch für die Stämme und Isolate der Ordnung Phasianiformes war. Die Infektion von Sperlingen durch Geflügelpockenvirus (FWPV) wird in der Arbeit diskutiert. Darüber hinaus führten die Isolate des Triels (Ordnung Charadriformes) und des Habichts (Ordnung Accipitriformes) ebenfalls zu dem Sperlingsvögel -spezifischen Spaltbild. Zehn Pockenvirussolate und zwei -stämme wurden darüber hinaus sequenziert und phylogenetisch analysiert. Die Ergebnisse der REA wurden durch die phylogenetische Analyse bestätigt.

The aim of the present study was to establish a polymerase chain reaction (PCR) as molecular biological tool for routine diagnosis and differentiation of avian poxviruses. For testing the specificity of this PCR, fowlpox vaccine (FWPV HP-B) and samples from which fowlpox viruses were diagosed by conventional methods, were investigated. FWPV specific DNA was detected by amplifying a 578 bp fragment within the FWPV 4 b core protein gene. Examination of other avian viruses in this PCR revealed negative results. The agarose gel electrophoresis of PCR products was used for ascertaining the sensitivity of the PCR. FWPV specific DNA could be detected from a minimal amount of 150 copies of the genome. In comparison, the sensitivity was also ascertained by dot blot hybridization. With this technique a minimal amount of 75 copies of the genome could be detected. The sensitivity of the established PCR combined with agarose gel electrophoresis of PCR products seems to be sufficient and, because of its simple and rapid application superior to routine diagnosis. The established PCR was used to examine all samples, submitted for fowlpox virus diagnosis to the Institute of Poultry Diseases of the Free University Berlin between 2001 to 2003. After a distinctive increase of FWPV-outbreaks at the beginning of the investigations, a decrease was observed in 2002. Since the vaccination against fowlpox was not routinely used in the past, and after observation of several outbreaks till 2001, intensive vaccinations of poultry flocks were applied and resulted in distinct decrease in the numbers of cases in 2002. Futher, PCR in combination with restriction enzyme analysis (REA) was used as a molecular biological tool for differentiation of various avian poxviruses. With one primer set, it was possible to detect the DNA of 53 avian poxvirus strains or isolates from twelve bird species out of eight orders. REA of PCR products using EcoRV and NlaIII allowed to differentiate these eight orders into six different restriction patterns in most cases. All investigated strains and isolates of fowl and turkey (order phasianiformes), pigeon and ostrich (orders columbiformes and struthioniformes), falcon (order falconiformes), and agapornis (order psittaciformes) had specific restriction patterns and were distinguishable from each other. Problems only occured with poxvirus isolates from birds of the order of passeriformes. Isolates of a carrion crow, a pine grosbeak, three canary-birds and two sparrows had an identical restriction pattern ( passeriformes-pattern ) but there were two exceptions: the canarypox virus strains KP-1-V557 and KP-1 as well as one isolate from a canary-bird showed a different restriction pattern, because of one additional EcoRV site in the PCR fragment, and the investigation of two isolates of sparrows had an identical pattern to strains and isolates of the order phasianiformes. The infections of sparrows by FWPV will be discussed in this work. In addition to the problem mentioned above, the isolates of a stone curlew (order charadriformes) and of a hawk (order accipitriformes) also showed the passeriformes-pattern . Nucleotide sequence analysis and phylogenetic analysis of amplified fragments of ten isolates and two strains confirmed the results obtained by REA.