Bedeutung der myokardialen Tissue Factor-Expression für die myokardiale Struktur und Thrombogenität bei der inflammatorischen Kardiomyopathie.

Abstract

Entzündliche Prozesse beeinflussen das Gerinnungssystem. Durch die erhöhten Zytokin-Spiegel kommt es zu einer Veränderung der lokalen (gewebsspezifischen) und systemischen Hämostase. Tissue Factor (TF) nimmt in der Hämostase als Initiator der Blutgerinnung eine zentrale Rolle ein. TF kann durch Komplexbildung mit FVIIa neben der Initiation der Blutgerinnung auch zelluläre Signalkaskaden über PAR-2 steuern. Entzündliche Prozesse im Herzen führen zu einem gesteigerten Risiko von thrombotischen Ereignissen und sind mit einer erhöhten Mortalität verbunden. Im Myokard wird TF von Kardiomyozyten und Fibroblasten konstitutiv exprimiert. Experimentelle Studien zeigten bisher nur eine Assoziation zwischen der myokardialen Inflammation und der Entstehung von Thromben im Herzen. Bislang war jedoch nicht geklärt, ob myokardialer TF durch Zytokine induziert wird und damit auch die lokale Thrombusenstehung beeinflusst wird. Weiterhin ist unklar wie die TF-Expression in Kardiomyozyten auf transkriptioneller Ebene gesteuert wird und ob Kardiomyozyten die Thrombogenität der Umgebung durch Freisetzung von TF-positiven Mikropartikel (MP) beeinflussen. Anhand eines viralen Infektionsmodells wurde eine Myokarditis (MC) bei Mäusen induziert. Es zeigte sich in diesem Tierexperiment, dass die TF-Expression im Myokard im Verlauf der myokardialen Entzündungsreaktion ansteigt. Dies war auch mit einer erhöhten systemischen Thrombogenität verbunden. Aktiver myokardialer TF ko-lokalisierte mit eingewanderten Immunzellen und aktiviertem Endothel. Anhand von humanen Myokardbiopsien von Patienten mit vermuteter Virus-bedingter myokardialer Entzündung konnte ebenfalls eine positive Korrelation von TF mit der Aktivierung des Endothels beobachtet werden. Eine vermehrte TF-Expression war in den humanen Proben bei Vorliegen einer chronischen Entzündung jedoch nicht zu beobachten. Die Daten lassen darauf schließen, dass nur die akute und nicht die chronische Entzündung des Herzens mit einer erhöhten TF-Expression assoziiert ist. Mittels in vitro-Zellkulturexperimenten wurde bestätigt, dass die Transkription des kardiomyozytären TF-Gen durch TNF-α indzierbar ist. Ferner zeigte sich, dass Kardiomyozyten in der Lage waren TF-positive MP abzugeben, wodurch sich die Thrombogenität der Umgebung erhöhte. Die TF- Geninduktion und die MP-Freisetzung waren mit der Aktivierung des intrazellulären JNK-Signalweges verbunden. In Ko-Kultivierungsversuchen von Endothelzellen mit Kardiomyozyten wurde beobachtet, dass kardiomyozytäre MP unter inflammatorischen Bedingungen die Fähigkeit besaß, durch eine endotheliale Zellschicht zu diffundieren. Die Diffussionsfähigkeit wurde durch einen bislang unbekannten Mediator der Kardiomyozyten begünstigt. Des Weiteren wurden im Plasma von Patienten mit akuter myokardialer Schädigung, einem Myokardinfarkt, MP nachgewiesen, auf denen sowohl Kardiomyozyten-spezifische Antigene als auch TF nachweisbar waren. Es lässt sich deshalb folgern, dass Kardiomyozyten nach Stimulation mit Zytokinen thrombogene MP freisetzen und diese nach Diffusion durchs Endothel die Thrombogenität des Plasmas erhöhen. Ferner wurde in dieser Arbeit untersucht, ob die TF-Expression der Kardiomyozyten neben seiner Bedeutung bei der Initiation der Blutgerinnung noch eine Bedeutung für das zelluläre Überleben besitzt. Dafür wurden Kardiomyozytenzellinien generiert, die unterschiedliche TF-Expressionsspiegel aufwiesen. Das Überleben der HL-1 Kardiomyozyten unter inflammatorischen Bedingungen wurde anhand von Stimulationen mit verschiedenen TNF-α-Konzentrationen in vitro analysiert. Es zeigte sich, dass eine Überexpression von TF Kardiomyozyten vor TNF-α-induzierter Apoptose schützte. Dieser Schutz war ebenfalls nach Stimulation mit der Apoptose-induzierenden Substanz Campothecin nachweisbar. Die positive Auswirkung der zellulären TF- Expression wird möglicherweise über den anti-apoptotisch-wirkenden AKT-Pathway vermittelt. Der beobachtete TF-vermittelte Schutz vor Zytokin-induzierten Apoptose könnte durch eine TF/FVIIa-bedingte PAR-2-Aktivierung zu erklären sein. Zusammenfassen lassen sich die Ergebnisse der Arbeit wie folgt: 1.) Eine myokardiale Entzündung, bedingt durch eine virale Infektion, führt zur einer Erhöhung der TF-Expression im Herzen in vivo, welche mit einer gesteigerten lokalen und systemischen Thrombogenität verbunden ist. 2.) Die kardiomyozytäre TF-Expression erhöht sich nach Stimulation mit TNF-α auf TF-mRNA-, -Protein- und -Aktivitätsebene in vitro. 3.) Kardiomyozyten können in vitro als Quelle für thrombogene MP dienen, die nach Zytokinstimulation abgeschnürt werden und bei Ko-Kultivierungsexperimenten durchs Endothel diffundieren. Ferner ist eine myokardiale Verletzung mit einer erhöhten zirkulierenden MP-Last in vivo assoziiert. Die nachgewiesenen MP weisen sowohl kardiomyozytäre Antigene als auch das TF-Protein auf. 4.) Die zelluläre TF-Expression der Kardiomyozyten vermitteln einen Schutz vor dem Zytokin-induzierten Zelltod in vitro. Bei diesem Schutz spielen AKT-vermittelnde Signaltransduktionswege eine Rolle. Weiterführende Untersuchungen, aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit, sind notwendig, um die involvierten Signalwege der TF-vermittelten Effekte genauer zu untersuchen. Dazu könnte der Einsatz von genetisch veränderten Tieren hilfreich sein. Als mögliche Modelle kämen Mäuse mit einem kardiomyozytären TF knock out und Mäuse, die eine PAR-2-Defizienz aufweisen, in Frage. Anhand dieser Modelle könnten in vivo-Untersuchungen durchgeführt und die Frage beantwortet werden, welchen Einfluss der kardiomyozytäre TF und die TF/FVIIa-vermittelte Signaltransduktion über PAR-2 auf das Überleben der Zellen in vivo hat.

Inflammatory processes have an impact on the coagulation system. Increased levels of inflammatory cytokines alter local (tissue specific) and systemic haemostasis. Tissue Factor (TF) plays a central, initiating role in blood coagulation. In addition to initiating coagulation, through complex formation with FVIIa, TF has an impact in regulating cellular signal cascades via protease activated receptor-2 (PAR-2) activation. Inflammatory processes within the heart lead to an increased risk for thrombotic events and are associated with increased mortality. TF is expressed by cardiomyocytes and fibroblasts within the myocardium. To date, experimental studies have only shown an association between myocardial inflammation and thrombus formation in the heart. It is still unknown, whether myocardial TF is induced by inflammatory cytokines and therefore whether cardiac thrombus development is affected. Moreover, neither the transcriptional regulation of the cardiomyocytic TF-gene nor the possible impact of cardiomyocytes upon extracellular thrombogenicity due to microparticle (MP) release have been investigated in detail. Myocarditis was induced after the viral infection of competent mice. In this animal model increased TF-expression was observed during myocardial inflammation reaction. This observation was associated with increased systemic blood thrombogenicity. Thrombogenic TF was co-localized with cellular infiltrates and activated endothelium within the inflamed myocardium. Furthermore, a positive correlation of TF-expression and endothelium activation was found in human myocardial biopsies from patients with suspected viral infection of the heart and myocardial inflammation. However, increased TF-expression was not observed in these biopsies. The data suggests that only the acute and not the chronic inflammation process within the heart is associated with increased TF-expression. In vitro cell culture experiments have demonstrated that transcription of the TF-gene in cardiomyocytes was inducible by TNF-α. Furthermore, this work demonstrated cardiomyocytes to be a source of thrombogenic MP. The TF-gene induction and MP release was JNK-dependent. Cardiomyocytic MP were able to diffuse through an endothelial monolayer under inflammatory conditions in co-cultivation experiments with endothelial cells and cardiomyocytes, thereby contributing to increased extracellular thrombogenicity. An as yet unknown cardiomyocyte- derived mediator was required to increase endothelial permeability. In addition, MP were detected in plasma obtained from patients with acute myocardial damage, such as after myocardial infarction. These circulating MP, when isolated from blood were positive for α-cardiac muscle actin and myosin and, therefore, were of cardiomyocyte origin. This suggests cardiomyocytes to release thrombogenic MP after stimulation with cytokines. These MP diffuse through the endothelium and increase plasma thrombogenicity. In this work it was further examined whether myocardial TF-expression had, in addition to the initiation of coagulation, an impact on cellular survival. Different HL-1 cardiomyocyte cell lines with altered TF-expression were generated. The survival of HL-1 cardiomyocytes was analyzed by varying TNF-α-concentration in vitro. The overexpression of TF in cardiomyocytes protected against TNF-α-induced apoptosis. This protection was also seen after stimulation with campothecin, a other apoptosis inducer. The observed effects may mediated by anti-apoptotic AKT. The TF-mediated protection against TNF-α-induced apoptosis may be explained by the TF/FVIIa-dependent PAR-2-activation. The findings of this work can be summarized as follows: 1.) Myocardial inflammation due to viral infection leads to an increased TF-expression within the heart in vivo. This is associated with a rise in local and systemic thrombogenicity. 2.) Cardiomyocyte TF-expression is increased after stimulation with TNF-α on mRNA, protein and activity level in vitro. 3.) Cardiomyocytes are a source of procoagulant MP under inflammatory conditions in vitro. These MP are able to diffuse through an endothelial monolayer in vitro. Furthermore, myocardial injury is associated with an increased level of circulating MP in vivo. 4.) Cellular TF-expression in cardiomyocytes serves as a protection against cytokine-induced cell death in vitro. This protection was AKT-dependent. Continuative experiments, building upon the results of this work, are necessary to investigate the signal pathways involved in the TF-mediated effects observed. The usage of genetically-modified mice would be helpful. Mice with a cardiomyocyte-specific TF deletion and PAR-2 -negative mice may be a potential animal model. Investigations with these mice strains may answer the open question which impact cardiomyocytic TF and the TF/FVIIa-mediated PAR-2-transduction have for cellular survival in vivo.