Charakterisierung der physiologischen Funktion des putativ tumorassoziierten Moleküls EBAG9 als Modulator der Exozytosefunktion in vitro und in vivo

Abstract

Das östrogeninduzierbare Protein EBAG9 (estrogen receptor-binding fragment- associated gene 9) wurde ursprünglich als ein neues tumorassoziiertes Antigen eingeführt, dessen Überexpression zu einer Generierung von Vorläufermolekülen der O-Glykosylierung in nicht-neuronalen Zellen führt. Inzwischen konnten allerdings weitere Untersuchungen nachweisen, daß das EBAG9-kodierte Genprodukt in nahezu allen humanen und murinen Geweben exprimiert wird. Da die physiologische Funktion des EBAG9-Moleküls weitgehend unklar ist, wurde in der vorliegenden Dissertation unter Verwendung des Hefe-2-Hybrid-Systems nach EBAG9-interagierenden Proteinen gesucht. So konnte das SNARE-assoziierte Protein Snapin, ein modulatorisches Molekül im Prozeß der Ca2+-regulierten Exozytose in neuronalen und chromaffinen Zellen, als Interaktionspartner von EBAG9 identifiziert werden. Snapin interagiert phosphorylierungsabhängig mit dem t-SNARE-Molekül SNAP25 und verstärkt dadurch die Rekrutierung des Ca2+-Sensormoleküls Synaptotagmin zum SNARE-Komplex. Die Spezifität der direkten Interaktion von EBAG9 mit Snapin konnte im Hefesystem, in vitro in GST-Bindungsstudien und in vivo durch Koimmunpräzipitationsexperimente verifiziert werden. Weitere Hinweise für eine in vivo-Assoziation von EBAG9 und Snapin sind (1) die Koelution der endogen exprimierten Proteine nach einer Gelfitration von PC12-Zellysaten und (2) die partielle Kolokalisation beider Moleküle an perinukleären Membranen in HEK293-Zellen. Durch Deletionsanalysen konnten die relevanten Proteinbereiche der EBAG9-Snapin-Assoziation bestimmt werden, wobei die N-terminale coiled-coil-Domäne von Snapin sowie die N-terminale Domäne (AS 8-27) im EBAG9-Molekül essentiell für die Proteininteraktion waren. Zudem dienten die drei Cysteinreste der Snapin- interagierenden Domäne im EBAG9-Molekül als Akzeptorstellen für Palmitinsäurereste und waren essentiell für die periphere Membranassoziation des EBAG9-Proteins. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen und subzelluläre Fraktionierungsexperimente von PC12-Zellen zeigten, daß EBAG9 im Verlauf der neuronalen Differenzierung einer dynamischen Umverteilung von einem perinukleären Kompartiment hin zu sekretorischen Vesikeln, darunter sind small synaptic vesicles und large dense-core vesicles , unterliegt. Damit wäre EBAG9 als Snapin-interagierendes Molekül gut positioniert, eine Rolle bei der Ca2+-regulierten Exozytose sekretorischer Granula einzunehmen. Die funktionelle Relevanz der EBAG9-Snapin-Assoziation konnte durch die Überexpression von EBAG9 in der neuroendokrinen Zellinie PC12 gezeigt werden, die zu einer signifikanten Reduktion (» 50%) der Ca2+-abhängigen Freisetzung des Neurotransmitters Neuropeptid Y und des Katecholamins Norepinephrin führte. Intrazelluläre, konstitutive Transportwege hingegen blieben durch die EBAG9-Überexpression unbeeinflußt. Die durch EBAG9 bewirkte Reduktion der basalen Snapin-Phosphorylierung sowie funktionelle Störung der Snapin-Bindung an seinen Interaktionspartner SNAP25 könnte dabei die mechanistische Grundlage für die inhibitorische Aktivität von EBAG9 im Prozeß der Vesikelexozytose bilden. Gleichermaßen inhibiert EBAG9 auch die Assoziation von Snapin mit dem ubiquitären t-SNARE-Homolog SNAP23 und legt damit eine Rolle für EBAG9 im Rahmen der Ca2+-abhängigen Vesikelexozytose in einer weitaus größeren Anzahl von Zelltypen nahe. Mit Hilfe der homologen Rekombination in ES-Zellen konnten erstmals konstitutive EBAG9-defiziente Mäuse generiert werden, die es ermöglichten, die in vivo-Funktion von EBAG9 im Rahmen von Vesikeltransport- und Exozytoseprozessen zu untersuchen. Als Modellsystem wurde die Ca2+-abhängige Freisetzung lytischer Granula aus zytotoxischen CD8+-T-Zellen untersucht. Im Einklang mit den in vitro-Untersuchungen in PC12-Zellen war in den EBAG9-deletierten Mäusen die Ca2+-abhängige Freisetzung der lytischen Vesikelmarkerproteine Granzym A und -Hexosaminidase signifikant erhöht (» Faktor 2). Andere Transportwege immunologisch relevanter Zytokine waren in den CD8+-T-Zellen nicht durch das Fehlen von EBAG9 beeinflußt. Die Bestimmung der Zymogengranulavolumina im exokrinen Pankreas deutet auf eine indirekte Funktion von EBAG9 im Rahmen der Vesikelexozytose hin. Die Deletion von EBAG9 führt dort zu einer durchschnittlichen Vergrößerung des Zymogengranulavolumens (» 60%) und legt eine Rolle von EBAG9 in der Biogenese und Reifung sekretorischer Granula nahe. Zusammengefaßt konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß das physiologisch vorkommende Protein EBAG9 neben einer putativen Rolle in Tumoren auch eine physiologische Rolle in der Regulation von Vesikelkreisläufen in eukaryotischen Zellen einnimmt.

The estrogen-responsive protein EBAG9 (estrogen receptor-binding fragment- associated gene 9) was originally described as a novel tumor-associated antigen, which causes the occurence of normally cryptic O-linked glycans in non-neuronal cells. However, this molecule is expressed physiologically in most mammalian and murine tissues. Since the physiological function of the EBAG9-encoded gene-product is largely unknown, I scored for interaction partners employing the yeast two-hybrid system. In the present study, the SNARE-associated protein Snapin was identified as the first interaction partner of EBAG9. Snapin is thought to have a positive modulatory role in the process of Ca2+-dependent exocytosis in neuronal and chromaffin cells. Snapin interacts with the t-SNARE protein SNAP25 in a phosphorylation-dependent manner and subsequently improves the binding affinity of the putative Ca2+ sensor Synaptotagmin to the SNARE-complex. The specificity of the EBAG9-Snapin association was confirmed in the yeast system, in vitro by GST-pulldown assays and in vivo by coimmunoprecipitation experiments. Further observations support an in vivo interaction of EBAG9 and Snapin: (1) coelution of the endogenously expressed proteins EBAG9 and Snapin after gelfiltration of PC12 cell extracts and (2) partial colocalisation of both proteins at perinuclear membranes. Using binding assays with truncated fusion proteins, the interaction domains essential for EBAG9-Snapin association were mapped to the N-terminal domain of EBAG9 and the N-terminal coiled-coil domain of Snapin. Furthermore, the Snapin-interacting domain of EBAG9, which contains three cysteine residues, was shown to be palmitoylated and thus provides a lipid anchor for peripheral membrane association of EBAG9. Immunofluorescence analysis and subcellular fractionation experiments revealed that EBAG9 is subject to a dynamic redistribution upon NGF-induced differentiation in neuroendocrine PC12 cells. More specifically, a population of EBAG9 molecules redistributed differentiation-dependent from a perinuclear compartment to secretory granules, among them small synaptic vesicles and large dense-core vesicles. Thus, I conclude that the Snapin-interacting protein EBAG9 in all likelihood has an important role in Ca2+-dependent exocytosis of secretory vesicles. Overexpression of EBAG9 inhibited regulated release of neuropeptide Y and norepinephrine from PC12 cells, thus demonstrating the functional relevance of the EBAG9-Snapin association. In contrast, intracellular constitutive trafficking pathways remained unaffected upon EBAG9 overexpression. Mechanistically, EBAG9 decreased basal phosphorylation of Snapin, which subsequently attenuated Snapin binding to SNAP25. Likewise EBAG9 impeded association of Snapin and SNAP23, the widely expressed homologue of SNAP25. This observation suggests a more general role for EBAG9 in membrane fusion events in non-neuronal cells as well. To examine the function of the EBAG9-encoded gene product in vivo, I generated a targeted null mutation of the EBAG9 gene in the mouse by homologous recombination in embryonic stem cells. In agreement with the results from overexpression of EBAG9 in neuroendocrine PC12 cells, I observed a reverse phenotype in EBAG9 deficient mice since regulated release of the lytic granule mediators granzyme A and -hexosaminidase is enhanced twofold in cytotoxic T-lymphocytes. In contrast, the trafficking of other immunological relevant molecules was not affected by the deletion of the EBAG9 protein. In addition, the size and volume of secretory granules were significantly increased in the exocrine pancreas of EBAG9-deficient mice. This observation suggests a more indirect role for EBAG9 in the process of vesicle exocytosis, possibly mediated by interference with the granule biogenesis or maturation pathway. In conclusion, the present study shows that in addition to a putative function in tumor cells, the ubiquitously expressed protein EBAG9 has a physiological role in the regulation of the secretory vesicle cycle in eukaryotic cells.