Epidemiology and Ecology of Bacillus cereus biovar anthracis in Taï National Park, Côte d’Ivoire

Abstract

Sudden death was observed in chimpanzees and gorillas in Côte d’Ivoire (Taï National Park) and Cameroon (Dja Reserve) in 2001 and 2004 and the causative agent was identified as a before unknown Bacillus anthracis-like bacterium designated Bacillus cereus biovar anthracis (Bcbva) (1, 2). Bcbva combines the chromosomal background of B. cereus with the virulence plasmids of B. anthracis and was shown to be as virulent as B. anthracis in small animal models (3). As part of an ongoing long-term study in Taï National Park (TNP), autopsies on all available deceased wildlife were performed and environmental samples were collected. Bcbva positive samples dated back up to 1991 and Bcbva was identified as a continuous cause of death for a number of large mammal species (4). The aim of the present study was to investigate the epidemiology and ecology of Bcbva in its natural rainforest habitat in TNP using a broad array of phylogenetic and serological methods. Bacterial isolates could be retrieved from various sample types (tissue samples, bones, carrion flies) and 178 whole Bcbva genomes were derived covering a period from 1996 to 2014. SNP-based phylogenomic analysis in a Bayesian statistical framework revealed that Bcbva chromosomes had measurably evolved over this time span. This allowed us to determine that the median time to their most recent common ancestor (tMRCA) was 146 years (95 % highest posterior density (HPD): 70-237) and that 0.2 new mutations are introduced in average per Bcbva chromosome/year. Bayesian Markov Chain Monte Carlo (BMCMC) analyses were run under several demographic models. No model outperformed a constant population size model, suggesting Bcbva population size did not vary much over this period. To further inform the latter, in vitro experiments were performed determining the whole genome mutation rate of Bcbva, which was shown to be comparable to the in vitro mutation rate of B. anthracis. Comparison of Bcbva evolutionary rate and in vitro mutation rate approximated hypothetical Bcbva activity to be in average 102 generations/year, pointing against a significant extra mammalian lifecycle of Bcbva.The whole genome sequencing data provided evidence for multiple co-existing transmission chains that appear to be localized within different areas of the park. Genomic and geographic distances were correlated, particularly when genomic distances were low, reflecting the carcass-mediated dynamics of the disease. To reveal further possible transmission pathways, carrion flies were trapped in the rainforest canopy and we were able to isolate Bcbva from flies caught up to 25m high. While we observe constant substantial pressure by Bcbva on the TNP fauna, only two monkeys were found to have significant amounts of antibodies against the disease in a serological study in five different wildlife species (n=59), indicating that Bcbva-infections in these species are likely often lethal. Combining data from TNP with sequence data from other sites of Bcbva occurrence revealed that Bcbva has been present in sub-Saharan Africa for millennia.

Der plötzliche Tod von Schimpansen in Côte d’Ivoire (Taï National Park) und Gorillas in Kamerun (Dja Reservat) in den Jahren 2001 und 2004 wurde von einem unbekannten Bacillus anthracis-ähnlichen Erreger verursacht, der später als Bacillus cereus biovar anthracis (Bcbva) bezeichnet wurde. Bcbva kombiniert den chromosomalen Hintergrund von Bacillus cereus mit den Virulenzplasmiden von Bacillus anthracis. In Tierversuchen wurde gezeigt, dass die Virulenz von B. cereus und B. anthracis vergleichbar ist. Im Rahmen einer Langzeitstudie im Taï National Park (TNP) wurden alle gefundenen Wildtierkadaver autopsiert und Umweltproben gesammelt. Bcbva positive Proben reichen zurück bis 1991 und es konnte gezeigt werden, dass Bcbva kontinuierlich Todesfälle bei mehreren Säugetierarten verursacht. Das Ziel dieser Dissertation war es, unter Anwendung phylogenetischer und serologischer Methoden die Epidemiologie und Ökologie von Bcbva im Taï Nationalpark, dem natürlichen Regenwaldhabitat des Erregers, zu untersuchen. Bcbva konnte aus verschiedenen Probenmaterialien kultiviert werden (Gewebe, Knochen, Aasfliegen) und 178 Bcbva Vollgenome wurden sequenzanalysiert. Diese decken den Zeitraum von 1996 bis 2014 ab. SNP-basierte phylogenetische Analysen unter Anwendung bayesischer statistischer Methoden zeigten eine messbare Evolution des Erregers über diesen Zeitraum. Die Zeit bis zum letzten gemeinsamen Vorfahren der Isolate (tMRCA) beträgt 146 Jahre (95% Konfidenzintervall: 70-237 Jahre) und pro Bcbva Chromosom und Jahr enstehen im Durchschnitt 0.2 neue Mutationen. In bayesischen Monte-Carlo-Sampling-Verfahren (BMCMC) unter Annahme verschiedener demografischer Szenarien war kein Modell wahrscheinlicher als die Annahme einer konstanten Bakterienpopulation. Dies deutet darauf hin, dass die Größe der Bakterienpopulation über diesen Zeitraum nicht bedeutend variiert hat. Um diese Ergebnisse besser einordnen zu können, wurde die Mutationsrate des Bcbva Gesamtgenoms in in vitro Experimenten bestimmt. Diese ist vergleichbar mit der Mutationsrate von B. anthracis. Der Vergleich der Evolutions- und der Mutationsrate von Bcbva deutet darauf hin, dass der Erreger im TNP im Durschnitt pro Jahr nur 102 Generationen durchläuft. Dies spricht gegen eine bedeutende Vermehrung des Erregers außerhalb von Säugetierwirten. Weiterhin deckten die Sequenzdaten mehrere parallele Infektionsketten in unterschiedlichen Teilen des Parks auf. Für kleine genomische Distanzen sind genomische und geographische Distanz der Isolate korreliert, eine typische Folge der Ansteckung an eingegrenzten Quellen, z.B. Kadavern. Um weitere mögliche Übetragungswege aufzudecken, wurden Aasfliegen auch im Blätterdach des Regenwaldes gefangen. Bcbva konnte aus Fliegen aus einer Höhe von bis zu 25m kultiviert werden. Trotz des großflächigen, konstanten Drucks von Bcbva auf die TNP Fauna zeigten in einer serologischen Studie in fünf Wildtierspezies (n=59) nur zwei Affen eine eindeutige Antikörperantwort gegen Milzbrand. Dies ist ein Hinweis dafür, dass Bcbva-Infektionen in den getesteten Spezies oft tödlich enden. Abschließend führte eine Kombination unserer im TNP erhobenen Daten mit Bcbva Sequenzdaten aus anderen Ländern zu der Einschätzung, dass Bcbva schon seit mehreren tausend Jahren im Afrika südlich der Sahara existiert.