Entwicklung neuer Bildgebungsverfahren zur Diagnose von chronisch entzündlichen Erkrankungen im Tiermodell

Abstract

Die Verhinderung von Pathogenesen und Entwicklung gezielter therapeutischer Behandlungsstrategien sind die Hauptziele der modernen Biomedizin. Daher ist es unabdingbar Zell- und Gewebefunktionen im naturgetreuen Kontext, den lebenden Organismus, beobachten zu können. Zu diesem Zweck werden Tiermodelle eingesetzt, die unter anderem verschiedene Aspekte chronisch entzündlicher Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) simulieren. Dabei ist der Zugang zum Cortex, Hirnstamm oder Rückenmark meist nur durch invasive und oft terminale Eingriffe möglich, wodurch wiederholte Aufnahmen in einem Individuum in verschiedenen Stadien der Erkrankung nicht möglich sind. Die Retina hingegen ist der einzige Bestandteil des ZNS, welcher durch optische Methoden nichtinvasiv abgebildet werden kann. Dabei können Veränderungen in der Retina auch Prozesse in anderen Regionen des ZNS widerspiegeln und somit indirekt charakterisiert werden. In diesem Sinne ist in dieser Arbeit eine neuartige Methode entwickelt worden, mit dessen Hilfe die Retina von lebenden Mäusen longitudinal untersucht werden kann. Sie basiert auf der Zwei-Photonen-Mikroskopie, wodurch zelluläre Infiltration und Interaktion in vivo beobachtet werden können. Erprobt wurde die neue Methode am Mausmodell der experimentellen autoimmunen Uveoretinitis (EAU), bei der autoreaktive T-Zellen die Blut-Retina-Schranke überwinden und eine Gewebeschädigung durch Rekrutierung von weiteren peripheren Leukozyten einleiten. Dabei stellte sich in der vorliegenden Arbeit heraus, dass der Prozess der Retinainfiltration von CD4 + T-Zellen und LysM + Phagozyten vom Sehnervkopf aus beginnt und sich radial zum äußeren Rand hin ausbreitet. Zudem konnte eine morphologische Veränderung und Ansammlung der CX3CR1 + Mikrogliazellen vor allem an beschädigten Blutgefäßen festgestellt werden. Des Weiteren konnten aktivierte und hochmotile CX3CR1 + Zellen im perivaskulären Raum beobachtet werden. Interessanterweise bewegt sich die Mehrheit dieser Zellen in Mäusen mit EAU in Richtung des Sehnervkopfs, im Gegensatz zu den Zellen in den gesunden Kontrollen. Funktionelle Calciummessungen in der Retina während der EAU zeigen, dass bis zu 28 Tage nach Immunisierung keine signifikant schädigende Erhöhung des intrazellulären Calciums in den Ganglienzellen eintritt. Dank der neu entwickelten Methode können nun immunrelevante Prozesse mit zellulärer Auflösung über den gesamten Krankheitsverlauf chronisch entzündlicher Erkrankungen evaluiert werden.

Preventing pathogenesis and developing selective therapeutic strategies are the main goals in modern biomedicine. Therefore, it is absolutely necessary to probe cellular and tissue functions in the living organism. Animal models can be used to study different aspects of chronic inflammatory diseases taking place in the central nervous system (CNS). Imaging the brain stem, spinal cord or cortex needs invasive and often terminal surgery. Thus, longitudinal measurements in one and the same animal at several time points during the whole time course of disease are not possible. The retina is the only part of the CNS that can be imaged non-invasively by optical methods. Changes in the retina may reflect pathogenesis from other parts of the CNS as earlier studies have shown e.g. in patients with multiple sclerosis in which thinning of the retinal nerve fiber layer is one of the first symptoms. In the here presented work a new method has been developed to observe the retina from living mice longitudinally. The method is based on the two-photon-absorption, thereby near infrared radiation is used to excite fluorescent proteins or dyes. This allows imaging of cellular infiltration, migration and function of fluorescently labelled leukocytes in vivo. The new approach was tested in the animal model for experimental autoimmune uveoretinitis (EAU) where T cells overcome the blood-retinal-barrier to inflict retinal inflammation followed by recruitment of peripheral leukocytes that induce tissue damage. The process of CD4 + T cell infiltration starts from the optic nerve head towards the retinal periphery followed by LysM + phagocyte infiltration in a radial manner. The CX3CR1 + microglia show a change from a more probing state towards an activated phenotype and accumulate mainly around disrupted blood vessels. A small population of activated and highly motile CX3CR1 + cells could only be observed in the perivasculature. Interestingly, most of this motile cells are moving towards the optic nerve head in mice affected by EAU compared to healthy controls. Unexpectedly, functional calcium measurements during the course of EAU up to 28 days after immunisation showed no significant increase in intracellular calcium levels as an indicator for cellular apoptosis in the ganglion cell layer. The newly developed approach allows longitudinal retinal imaging of cellular infiltration, migration and function over time repeatedly over the whole course of chronic inflammatory diseases. This method is not only limited to ocular diseases but also can be used to observe indirectly pathogenic processes of the CNS.