Untersuchungen zum Wirkmechanismus der Procyanidin-induzierten Vasorelaxation an isolierten Arterien vom Schwein

Abstract

Zahlreiche epidemiologische und klinische Studien haben eine inverse Korrelation zwischen dem Verzehr polyphenolreicher Lebensmittel und der Mortalität sowie Morbidität von Herz-Kreislauf-Krankheiten aufgezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Hauptaugenmerk auf eine mögliche therapeutische Relevanz der hochgereinigten und chemisch definierten di- bis hexameren 2,3-trans-[4α,8]- (Salix spp.; Salicaceae) und 2,3-cis-[4ß,8]- Procyanidine (Nelia meyeri SCHWANT.; Mesembryanthemacea) gelegt. Zur Überprüfung der Procyanidin-vermittelten Vasorelaxation von Koronararterien des Schweins (Innendurchmesser 2-3 mm) wurden Endothel-intakte Ringe in Organbädern mit U46619 kontrahiert. Durch kumulative Zugabe der polyphenolischen Testsubstanzen kam es zu einer konzentrationsabhängigen Relaxation des Gewebes. Durch die mechanische Entfernung des Endothels konnte dieser Effekt auf die Gefäßmuskulatur nahezu verhindert werden. Die Ergebnisse von Inhibitions- bzw. Aktivierungs-Experimente zeigten sowohl eine Beteiligung des durch Aktivierung der endothelialen NO-Synthase (eNOS) und der löslichen Guanylylcyclase gekennzeichneten NO-Signalwegs als auch der Phosphoinositid-3-Kinase/Proteinkinase B (PI3K/Akt) der Endothelzelle. Unterstützend dazu ergaben Western-Blot Analysen eine konzentrationsabhängige Expression der p-Akt und der p-eNOS in Anwesenheit der Procyanidine in HUVECs. Als weitere beteiligte Signalkaskade konnten Hinweise für eine EDHF- vermittelte Relaxation aufgezeigt werden. So kam es in Anwesenheit der Procyanidine zu einer Aktivierung der endothelialen KCa-Kanäle. Desweiteren wurde die Bedeutung von freien, intrazellulären Calcium-Ionen ([Ca2+]i) im Endothel untersucht, da diese nachweislich im Zytosol an der Aktivierung der eNOS und der IKCa bzw. SKCa beteiligt sind. Eine weitere bedeutende Rolle in der Signalkaskade der Procyanidin-vermittelten Relaxation spielen Reaktive Sauerstoff Spezies (ROS), insbesondere das Superoxid-Anion (O2-). Mit Hilfe von Western-Blot Analysen in An- bzw. Abwesenheit von Inhibitoren und unter Verwendung des DCFH-DA-Assay wurde die essentielle Rolle von ROS/ O2- in HUVECs bestätigt. Als mögliche endotheliale ROS-Quellen konnten die NADPH- Oxidase, Xanthinoxidase und die Atmungskette identifiziert werden, wobei die Beteiligung dieser in Abhängigkeit der jeweiligen Stereochemie des Procyanidins stand. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das antioxidative Potential der Procyanidine sowie deren gefäßprotektive Wirkung gegenüber Lipoproteinen in vitro untersucht. Mit Hilfe eines Lipoprotein-Assays konnten die gefäßschützenden Eigenschaften der 2,3-cis- und 2,3-trans Procyanidine unter pathologischen Zuständen gegenüber oxLDL aufgezeigt werden. Zusätzlich konnte in verschiedenen in vitro-Experimenten eine starke antioxidative Wirkung (Xanthinoxidase-Assay) und ein hohes Radikalfänger-Potenzial (Griess- Assay, DPPH-Assay) der getesteten Procyanidine nachgewiesen werden.

Numerous epidemiological and clinical evidences have indicated an inverse correlation between the regular consumption of polyphenol-rich food and risk for developing cardiovascular diseases. In the present study, we focused on the vasorelaxant potentials of highly purified and chemically defined procyanidin samples composed of di- to hexameric 2,3-trans-[4α,8]- (Salix spp.; Salicaceae) and 2,3-cis-[4ß,8]-procyanidins (Nelia meyeri SCHWANT; Mesembryanthemaceae), respectively. To verify the potential vasorelaxant effects of these procyanidins, U46619-pre-contracted porcine coronary arteries (inner diameter: 2 to 3 mm) were incubated with the tested samples. In endothelium-intact arteries the procyanidin samples evoked a concentration- dependent relaxation, while endothelium-denuded rings did not show relaxant responses. To get insight into the underlying relaxing mechanism(s) induced by the procyanidins, experiments were performed in the presence of inhibitors of distinct signalling pathways. These studies clearly demonstrated a major role of the NO signalling pathway, evident from activation of eNOS and sGC, respectively. The PI3K/Akt signalling pathway was identified as an upstream effector of the NO signalling pathway. Confirmatory evidence of the activation of Akt and eNOS was obtained by Western blotting using HUVECs. The procyanidin samples induced the phosphorylation of these enzymes in a concentration- dependent manner. EDHF-mediated responses are caused by different factors, including the activation of endothelial calcium-activated potassium channels (KCa). Experiments with KCa subtype inhibitors showed an involvement of IKCa and SKCa in the relaxant response to procyanidins. Moreover, the importance of an increase in endothelial [Ca2+]i-levels for the activation of endothelial KCa channels and the eNOS was evaluated. Additional experiments using tissue bath studies, Western blot analyses and the DCFH-DA assay indicated a key role for an intracellular redox-sensitive mode of action in eNOS activation triggered by the procyanidins, with superoxide-anion (O2-) as crucial species. NADPH oxidase, xanthine oxidase and the respiratory chain were identified as potential sources of ROS, with conspicuous differences in the origin of ROS with respect to 2,3-cis and 2,3-trans procyanidins. The second part of this work was addressed to beneficial vasoprotective effects of the procyanidins against oxLDL under in vitro conditions. The endothelium-dependent relaxation to bradykinin was significantly reduced in rings incubated with oxLDL. This detrimental effect of oxLDL was completely inhibited by pre-incubations with procyanidins. Thus, our results indicate that 2,3-trans and 2,3-cis procyanidins may exhibit vasoprotective effects against oxLDL in pathological conditions such as atherosclerosis. Finally, the procyanidins tested also showed strong antioxidant (xanthinoxidase assay) and radical scavenging activities (Griess assay, DPPH-free radial method) under in vitro conditions.