Immunmodulation der Th-Zellreaktion mittels DNA Immunisierung

Abstract

Th-Zellen regulieren den Ausgang von Immunreaktionen u.a. durch die Sekretion von Zytokinen. Naïve Th-Zellen erhalten nach Antigenstimulation im Rahmen ihres Differenzierungs-prozesses eine Prägung für bestimmte Zytokinmuster. Von dieser Prägung hängt wesentlich ab, ob es in Antwort auf das Antigen zu einer angemessenen oder pathologischen Immunantwort kommt. In den Differenzierungsprozess der Th-Zellen einzugreifen, ist daher eine Strategie, Autoimmunkrankheiten zu behandeln. Eine Möglichkeit einer solchen Einflussnahme ist die DNA Immunisierung. Bei dieser wird DNA in Form einfacher Expressionsplasmide appliziert, und es kommt zur Immunantwort gegen das in vivo produzierte Protein. Durch Koapplikation von DNA, die immunmodulatorische Proteine codiert, kann der Ausgang der Immunantwort gezielt beeinflusst werden. In dieser Arbeit wurden verschiedene DNA Koimmunisierungen mit Zytokinen und Kostimulatoren mit dem Ziel durchgeführt, antigenspezifische Th- Zellen zu induzieren, die die Wirkung bzw. Entstehung pro-inflammatorischer Th1 Zellen unterdrücken. Da die Zahl der antigenspezifischen Th-Zellen im nicht immunisierten Tier für eine direkte Analyse zu gering ist, wurde ein Transfersystem verwendet, mit dessen Hilfe es möglich war, die frühe Th-Zell- differenzierung nach DNA Immunisierung auf Einzelzellebene zu analysieren. Unter den getesteten Immunisierungen stellte sich die GeneGun als die zuverlässigste Route heraus. Sie induzierte eine gut reproduzierbare Th- Zellreaktion, die in ihrer Stärke einer Immunisierung mit Protein+Adjuvanz glich. Aufgrund der verwendeten Untersuchungsmethode konnten wir erstmalig zeigen, dass die GeneGun eine Th1 Antwort mit einem Übergewicht an IFNγ über IL-4 Produzenten induziert. Auch konnte mit Hilfe dieser Methode erstmalig der Einfluss verschiedener DNA Koimmunisierungen auf die unmittelbare Th- Zellreaktion analysiert werden. Dabei zeigte sich, dass das zentrale Th1 Differenzierung induzierende Zytokin IL-12 wie erwartet eine deutliche Th1 Verschiebung induzierte. IL-4 als zentrales Th2 Differenzierung induzierendes Zytokin, welches mit dem Ziel, Th2 Entwicklung zu fördern, bereits mehrfach in DNA Koimmunisierungsstudien therapeutisch verwendet wurde, induzierte völlig unerwartet ebenfalls Th1 Entwicklung. In einem Th1 abhängigen Arthritismodell verstärkte IL-4 Koimmunisierung die Krankheit. Diese Th1 Verschiebung wurde wahrscheinlich durch dendritische Zellen (DCs) vermittelt, deren erhöhte TNFα Produktion durch IL-4 Koimmunisierung wir auch zeigen konnten. Eine Bestimmung der Anzahl und des Phänotyps der direkt transfizierten DCs ergab, dass etwa 30 DCs pro drainierenden Lymphknoten nach GeneGun Immunisierung eine detektierbare Menge an Protein produzierten. Unser Ansicht nach kann diese geringe Zahl an direkt transfizierten DCs in Verbindung mit der großen Zahl an DCs, die durch residente Zellen produziertes Antigen aufnimmt und so ohne den Kostimulus präsentiert, als wesentliche Ursache für die unerwarteten Effekte einiger Koimmunisierungen angesehen werden. Für eine zuverlässige und rationelle Entwicklung potentieller DNA Immunisierung basierter Therapien müssen die Effekte der verwendeten Immunmodulatoren auf unterschiedliche Zelltypen in vivo berücksichtigt werden. Dies könnte z.B. durch die Restriktion der Expression des Antigens und des Kostimulus auf diejenigen Zellen geschehen, die tatsächlich das Antigen präsentieren.

Th cells regulate the immune response in part by the secretion of cytokines. Upon stimulation with antigen naive Th cells differentiate. During this differentiation they receive an imprinting for a certain cytokine profile. It depends on this imprint whether the immune response is adequate or pathologic i.e. autoimmune. Therefore the manipulation of this differentiation is a possibility to treat autoimmunity. This manipulation can be achieved through DNA immunisation. In DNA immunisation simple expression vectors are injected, resulting in an immune response against the in vivo produced protein. By co- injecting of DNA coding for immune modulating proteins this immune response can be modified. In this study several DNA co-immunisations were tested. Different cytokines and co-stimulating proteins were tested for their capacity to induce antigen specific Th cells capable of suppressing the development and effect of pro-inflammatory Th1 cells. Since the number of Th cells specific for a certain antigen in a not immunised animal is to low for direct analysis, we used a transfer system. That allowed the early analysis of the specific Th cell response to DNA immunisation on a single cell level. Among several tested immunisation routes the Gene Gun was the most reliable. It induced a reproducible Th cell reaction in strength comparable to that of immunisation using protein and adjuvans. Using this transfer system we showed for the first time, that the Gene Gun induced a Th1 profile with more IFNγ than IL-4 producing Th cells. The transfer system also allowed a detailed analysis of the Th cell response to different DNA co-immunisations. The major Th1 cell development inducing cytokine IL-12 shifted the immune response to Th1. The major Th2 inducing cytokine IL-4, that had been used in several DNA immunisation studies to induce Th2 development, surprisingly also induced a Th1 shift. In a Th1 dependent arthritis animal model IL-4 DNA co-immunisation worsened the disease. This Th1 shift was most likely mediated by dendritic cells (DCs). Supporting that we showed an increased TNFα production of the DCs after IL-4 DNA immunisation. A determination of the number and phenotype of these transfected DCs showed that around 30 DCs per draining lymph node produced a detectable amount of protein. We think that the effect of this low number of direct transfected DCs might be negligible if the majority of DCs takes up antigen produced by resident cells. DCs that take up antigen present the antigen without the co-stimulus. This might be a reason for the unexpected outcome of many DNA co-immunisations. To safely develop a DNA immunisation based therapy the effects of the immune modulating substances on the different cell types have to be considered. This could be done by limiting the expression of the antigen and the co-stimulating substances to the cells that actually present the antigen.