Untersuchung von NIRF Fluorkontrastmittel zur Detektion von Myokardinfarkten im Tiermodell

Abstract

Neuartige MRT Kontrastmittel auf der Basis von perfluorcarbonhaltigen Emulsionen (PFC) könnten die MRT Diagnostik erweitern. Aus diesem Grunde wurde im DHZB damit begonnen, perfluorhaltige MRT-Kontrastmittelemulsionen herzustellen und diese in vivo an Kleintiermo-dellen (Ratten) zu testen. Es ist aufwändig, diese Perfluorcarbone im Zielgebiet nachzuweisen. Als kostengünstigste Methode wurde aus Erfahrungen mit früheren Projekten die Nah-Infrarot Optik für den Nachweis des Perfluorcarbonöls im Zielgewebe mittels eines Nah-Infrarot-Fluoreszenz-(NIRF) Imagers favorisiert. Voraussetzung war, dass es in Vorversuchen gelang, die Ölphase vom Perfluoroctylbromid (PFOB) mit einem NIRF Farbstoff so zu markieren, dass die-ser Farbstoff sich nicht aus der Ölphase auswaschen ließ. Nach erfolgreicher Markierung wurde in dieser Machbarkeitsstudie damit begonnen, Emulsionen mit markiertem PFOB in einem Ratteninfarktmodell in vivo zu testen. Dazu wurden bei acht Ratten ein Myokardinfarkt mittels Ligatur des Ramus lateralis der Arteria interventricularis ante-rior provoziert. Bei den Tieren der Gruppe I wurde nach 3 Tagen, bei den Tieren der Gruppe II nach 20 Tagen PFOB-Kontrastmittel i.v. appliziert. Die Tiere der ersten Gruppe wurden am sechsten postoperativen Tag, die Tiere der zweiten Gruppe 21 Tage postoperativ in vivo, in situ und ex vivo im NIRF-Imager gemessen. Nach den in vivo Messungen wurde die Tiere euthanasiert, der Brustkorb eröffnet, die in situ Messung durchgeführt und dann die ex vivo Messungen am explantierten Herz wiederholt und histologisch (HE-Färbung), immunhistochemisch (CD68-Antikörper) und fluoreszenzmikrosko-pisch ausgewertet und verglichen. Bei den NIRF-Messungen konnte nicht abschließend geklärt werden, ob das detektierte NIRF-Signal durch die entstandene Thoraxnarbe oder vom infarzier-ten Myokard emittiert wurde. In situ konnte jedoch gezeigt werden, dass das Kontrastmittel nicht in das infarzierte Myokardareal gelangt war und sich die Infarktareale folglich als signalärmere Regionen abgrenzen ließen; es ließen sich keine Infarkte detektieren, die sich dorsal befanden. In den ex vivo Schnitten der Infarkttiere konnten alle Infarkte lokalisiert und ausgewertet werden. Bei den CNR Ergebnissen zeigte sich, dass das nicht infarzierte Gewebe in der Gruppe I ein 88 Mal höheres Fluoreszenzsignal und in der Gruppe II ein 109 Mal höheres Fluoreszenzsignal aufwies als das Infarktareal. Die Immunhistologie mit CD68-Antikörpern zeigte bei der Gruppe II mit 21 Tagen eine größere Makrophagenakkumulation im Infarktbereich als bei den Tieren der Gruppe I. Es ließ sich jedoch keine Anreicherung des Fluoreszenzfarbstoffes im nekrotischen Gewebe detektieren. Fluo-reszenzmikroskopisch ließ sich infarziertes von gesundem Myokardgewebe in gleicher Weise wie bei den ex vivo Untersuchungen unterscheiden. Die Daten dieser Studie zeigen damit, dass sich das NIRF-Imaging zur schnellen Überprüfung von Organbefunden bei der Entwicklung neuartiger Diagnostika im Tiermodell eignet.

Novel contrast agents based on perfluorocarbon (PFC) have the potential to appreciably enhance MRI diagnostics. For this reason, the German Heart Centre in Berlin has started to develop in-jectable PFC-laden emulsions and to test them on experimental models (rats). It can be costly to prove that the PFC-laden MRI contrast agent has reached the targeted region, hence, taking advantage of the know-how in near-infrared optics gathered from previous research projects, the use of an Near-Infrared-Fluorescence-(NIRF) Imager was chosen as an alternative for the detection of the emulsions in the target area. Essential to this undertaking is the previously achieved stable coupling of Perfluoroctylbromide (PFOB) with a fluorescent beacon in order to avoid a differentiated washing-out. We carried out the present feasibility study with the test of marked PFOB emulsions on a murine in-vivo infarc-tion model, elicited by the ligation of the ramus lateralis of the anterior interventricularis artery. The PFOB contrast agent was applied i.v. 3 days (group I) or 20 days (group II) after the surgical intervention, and in-vivo NIRF imaging was performed on the subsequent day (group II) or 3 days after operation (group I). The animals were sacrificed after an in-vivo NIRF measurement, then their thorax opened for in-situ imaging before their explanted hearts were individually imaged. Slices of myocardium were HE-stained and immunohistologically stained (CD68-Antibody); they were later imaged by means of an epifluorescence microscope. Analysis of planar imaging showed that NIRF imaging could not concludingly attribute the origin of the detected signal to the thoracic scar or to the infarcted myocardium. Still we could infer from in-situ images that the contrast agent did not reach the infarcted area, and that the latter could be characterised by its weaker fluorescence emission; dorsal infarctions could not be detected. Microscopic slices allowed for the localisation and quantification of infarcted tissue from operat-ed animals. Values of the Contrast-to-Noise-Ratio of the fluorescence signal in infarcted areas were 88 for group I and 109 for group II. Immunohistological evaluation showed that group II displayed a higher accumulation of macro-phages in the infarcted area than group I. No fluorescent contrast agent was detected in the ne-crotic tissue; hence we settled for the same criteria as for ex-vivo NIRF imaging to successfully discriminate infarcted from sane tissue. Results from this study acknowledge the adequacy of NIRF imaging for the rapid assessment of the organ-specific accumulation of novel contrast agents on animal models, under the pre-requisite of a stable coupling.