Structural and mechanistic analysis of membrane remodeling by Eps15-homology domain-containing protein 2

Abstract

Caveolae are flask-shaped invaginations of the plasma membrane. The Eps15-ho- mology domain-containing protein 2 (EHD2) was recently identified as a caveolar component. The cellular function of EHD2 at caveolae is, however, still unclear. EHD2 is a multi-domain, dimeric ATPase of the dynamin superfamily that tubu- lates negatively charged liposomes. The amino-terminal (N-terminal) G domain is followed by an α-helical domain, which is connected via a flexible linker to the carboxy-terminal EH domain. As a member of the dynamin superfamily, EHD2 might exhibit a mechano-chemical function. In this PhD thesis, the ATPase cycle and the structural transition of EHD2 in- duced by membrane binding were explored. The crystal structure of ADP-bound EHD2 resembled that of the previously determined ATP-bound form. This sug- gested that ATP hydrolysis does not induce a large scale conformational change. Next, the role of the N-terminus during membrane binding was studied. In solu- tion, the N-terminus was demonstrated to bind to a hydrophobic groove of the G domain using electron paramagnetic resonance (EPR) and X-ray crystallogra- phy. Continuous wave EPR spectra and accessibility measurements showed that upon liposome binding the N-terminus switches into the membrane. An EHD2 variant lacking the N-terminus exhibited reduced membrane remodeling activity and concomitantly lost membrane-stimulated ATP hydrolysis. Furthermore, lipid tubules formed by an EHD2 variant lacking the N-terminus did not show the characteristic striated pattern of wild-type EHD2 in electron microscopy. This im- plied that regular coat formation requires the N-terminus. Interestingly, deletion of the N-terminus did not change the residence time of EHD2 at caveolae. This suggested that the N-terminus of EHD2 might not be involved in caveolae binding but rather in ATPase-dependent remodeling of caveola membranes. It has been shown that the EH domain of EHD2 binds with micromolar affinity to the BAR- domain containing protein PACSIN2, which also resides at caveolae. However, recruitment of EHD2 to caveolae depended on the integrity of the KPFxxxNPF loop and not on the EH domain. A model was proposed where nucleotide-free EHD2 binds and deforms lipo- somes into tubular structures with an oligomeric EHD2 coat. Upon addition of ATP, the N-termini promote further membrane deformation.

Caveolae sind kolben-förmige Einstülpungen der Plasmamembran. EHD2 (Eps15-homology domain-containing protein 2) wurde neulich als ein Bestandteil von Caveolae identifiziert. Allerdings ist die zelluläre Funktion von EHD2 an Ca- veolae noch unklar. EHD2 ist eine multidomänen, dimere ATPase der Dynamin- Familie, welche negativ geladene Liposomen tubuliert. Auf die amino-terminale (N-terminale) G Domäne folgt eine α-helikale Domäne, welche mittels eines fle- xiblen Linkers mit der carboxy-terminalen EH Domäne verknüpft ist. Als Mitglied der Dynamin-Familie könnte EHD2 eine mechano-chemische Funktion ausüben. In der vorliegenden Arbeit wurden der ATPase Zyklus von EHD2 und struk- turelle Veränderungen, welche durch Membranbindung ausgelöst werden, unter- sucht. Die Kristallstruktur von ADP-gebundenem EHD2 ähnelte der vorher ge- lösten ATP-gebundenen Struktur. Das zeigte, dass die Hydrolyse von ATP keine großflächigen konformationellen Änderungen bewirkt. Als Nächstes wurde die Rolle des N-terminus während der Membranbindung untersucht. In Lösung wur- de mittels Elektronenspinresonanz (ESR) und Röntgenkristallographie gezeigt, dass der N-terminus in eine hydrophobe Tasche an der G Domäne bindet. ESR Spektren und Akzessibilitätsmessungen bewiesen, dass der N-terminus in Anwe- senheit von Liposomen an die Membran wechselt. Eine EHD2 Variante ohne den N-terminus zeigte eine verringerte Membranremodellierungsaktivität und verlor gleichzeitig die membran-stimulierte ATP Hydrolyse. Lipidröhrchen, die sich in Anwesenheit einer EHD2 Variante ohne N-terminus bildeten, zeigten in der Elek- tronenmikroskopie keine charakteristischen Riffelungen wie wildtyp EHD2. Das implizierte, dass die Bildung einer regelmäßigen Proteinhülle den N-terminus benötigt. Interessanterweise änderte die Deletion des N-terminus nicht die Ver- weilzeit EHD2s an Caveolae. Das bedeutete, dass der N-terminus wahrscheinlich nicht für die Membranbindung benötigt wird, sondern für die ATP-abhängige Re- modellierung der Caveola-Membranen. Es wurde gezeigt, dass die EH Domäne von EHD2 mit mikromolarer Affinität an das BAR Domäne enthaltende Protein PACSIN2 bindet, welches sich ebenfalls an Caveolae befindet. Allerdings hing die Rekrutierung von EHD2 an Caveolae von einer intakten KPFxxxNPF Schleife ab und nicht von der EH Domäne. Ein Modell wurde vorgeschlagen, in dem nukleotid-freies EHD2 Liposomen bindet und zu Röhrchen deformiert. Diese Röhrchen sind von oligomeren EHD2 umhüllt. Die N-termini vermitteln, nach Zugabe von ATP, eine weitergehende Membrandeformation.