Endothelinabhängige morphologische Veränderungen hypoxischer Astrozyten

Abstract

Viele Autoren haben die Morphologie von Astrozyten in hypoxischen oder ischämischen Gehirnen untersucht. Der Verlust astrozytärer Zellfortsätze während globaler zerebraler Ischämie wurde erstmals von Alzheimer 1910 beschrieben, der bemerkte, dass Astrozyten dabei eine amöboide Form mit deutlicher Reduktion der Oberfläche annahmen, was er als ?Clasmatodendrosis? bezeichnete. In neueren elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass nach zerebraler Hypoxie die normalerweise neuronalen Dendriten anliegenden Astrozytenfortsätze nur noch in stark vermindertem Ausmaß nachweisbar sind. Diese Veränderung der astrozytären Morphologie scheint eine verminderte Eliminierung von Neurotransmittern und Kalium aus dem Interstitium nach sich zu ziehen und damit die neuroprotektiven Effekte der betroffenen Astrozyten einzuschränken. Um die dieser Astrozytenreaktion zugrundeliegenden Mechanismen zu untersuchen, ist die Etablierung eines Zellkulturmodells notwendig. Allerdings konnten bisher an kultivierten Astrozyten unter Hypoxie keine morphologischen Veränderungen beobachtet werden, da diese eine fortsatzarme, epitheloide Morphologie ausweisen. In der vorliegenden Arbeit wurden daher mit Dibutyryl-cAMP vorbehandelte Astrozyten verwendet, da diese Substanz eine zellfortsatzreiche, differenzierte Morphologie induziert. Wurden diese Zellen einer 24-stündigen Hypoxie ausgesetzt, nahmen sie wieder die flache und fortsatzarme Morphologie unbehandelter Astrozyten an. Es war auf diese Weise also möglich, in Zellkultur einen der Clasmatodendrosis ähnlichen Prozess zu induzieren, was nahelegt, dass diese unabhängig vom Milieu und von der Mikroarchitektur des zentralen Nervensystems tattfindet. Eine Substanz, die ähnliche morphologische Veränderungen in kultivierten Astrozyten induzieren kann, ist Endothelin. Daher untersuchten wir den Einfluss von Hypoxie auf das astrozytäre Endothelin-System und dessen Einfluss auf die morphologische Transformation. Durch Northern Blots und Radioimmunoassay konnte gezeigt werden, dass Hypoxie zu einer Aktivierung des astrozytären Endothelin-Systems führt. So ist die ET- Konzentration in den Medienüberständen sowie die Präproendothelin-1-mRNA in Zellextrakten nach Hypoxie erhöht. Gleichzeitig kommt es zu einer transkriptionellen Down-Regulation des EndothelinA- und EndothelinB-Rezeptors, während Endothelin-Converting-Enzyme-mRNA in unveränderter Menge gebildet wird. Um zu untersuchen, ob diese Aktivierung des Endothelin-Systems die hypoxieinduzierte morphologische Transformation vermittelt, wurde durch nicht- selektive Endothelin-Rezeptorantagonisten die Endothelin-vermittelte Signaltransduktion blockiert. Dabei wurde der hypoxieinduzierte Verlust astrozytärer Zellfortsätze nicht mehr beobachtet, was nahelegt, dass das Endothelin-System die morphologischen Veränderungen vermittelt. Die Ergebnisse aus der vorgelegten Arbeit lassen vermuten, dass Endothelin an der Induktion morphologischer Veränderungen in Astrozyten während zerebraler Ischämie und Hypoxie beteiligt ist und daher ein mögliches Ziel der pharmakologischen Intervention bei diesen pathologischen Zuständen darstellt.

The morphology of astrocytes in a hypoxic or ischemic brain has been subject to extensive investigation. Loss of astrocytic processes during global cerebral ischemia was first described by Alzheimer in 1910, who realized that astrocytes assume an amoeboid shape with a clear reduction in surface area under these conditions, a process he termed ?clasmatodendrosis?. Recent studies using electron microscopy revealed that the number of astrocytic processes in close apposition to neuronal dendrites is substantially reduced after cerebral hypoxia. This transformation of astrocytic morphology seems to compromise elimination of neurotransmitters and potassium from the interstitial space ultimately resulting in a loss of neuroprotective effects of these cells. To elucidate the mechanisms of this astrocytic morphological transformation an experimental simulation in cell culture is needed. However, cultured astrocytes under baseline conditions display an epitheloid appearance with only few cytoplasmic processes and hypoxia does not produce any morphological changes. In this study we used cultured astrocytes pretreated with dibutyryl-cAMP, a substance inducing a highly differentiated morphology with multiple cytoplasmic processes. When subjected to 24 hours of hypoxia, these cells reassumed the flat and polygonal morphology of untreated astrocytes. Therefore, we were able to induce a process similar to ?clasmatodendrosis? in cultured cells suggesting a mechanism independent from the microenvironment of the central nervous system. The peptide endothelin is known to induce similar morphologic changes in cultured astrocytes. Therefore, the effect of hypoxia on expression of the astrocytic endothelin system and its role in the hypoxia-induced morphological transformation was studied. Northern blot analysis and radioimmunoassays revealed an activation of the astrocytic endothelin system in response to hypoxia. Both, endothelin-1 levels in cell culture supernatants and preproendothelin-1 mRNA in cell extracts were increased after hypoxia. In addition, transcription of endothelinA und endothelinB receptor mRNAs was down-regulated following hypoxia, while endothelin converting enzyme-2 mRNA remained unchanged. To investigate a possible causative role of endothelin in the morphological transformation induced by hypoxia, we used non-selective endothelin receptor antagonists to block endothelin-induced signal transduction. Application of these substances antagonized the hypoxia-induced morphological transformation suggesting a central role of the endothelin system in this response. These results indicate a potential role of the endothelin system in morphological changes of astrocytes after cerebral ischemia or hypoxia. Therefore, endothelin comprises a possible target for pharmacological intervention during these pathological states.