Identifizierung und Interpretation von Wirkstoffmetaboliten in der systematischen toxikologischen Analyse unter Verwendung der HPLC mit Photodiodenarray-Detektor (HPLC-DAD) und der Flüssigchromatographie mit Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TOF-MS)

Abstract

Metabolite spielen bei der analytischen Aufklärung und der Interpretation von Medikamentvergiftungen eine große Rolle. Daher wurde in dieser Dissertation unter dem besonderen methodischen Aspekt der HPLC mit Photodiodenarray- Detektor (HPLC-DAD) und der Flüssigchromatographie mit Flugzeit- Massenspektrometrie (LC-TOF-MS) systematisch untersucht, in welchem Maße eine Identifizierung von Metaboliten in der Praxis der systematischen toxikologischen Analyse von Todesfällen möglich ist. Im theoretischen Teil der Arbeit wurden zunächst die Grundlagen der Metabolisierung von Wirkstoffen im menschlichen Organismus dargestellt, die physikalisch-chemischen Prinzipien der angewendeten Methoden auch unter dem speziellen Aspekt des Nachweises von Metaboliten behandelt und die Fachliteratur zum Thema zusammengefasst, wobei der Schwerpunkt auf der relativ neuen LC-TOF-MS-Methode lag. Als wesentliches Probenmaterial wurde in dieser Arbeit Blut herangezogen, das allgemein die größte Bedeutung in der toxikologischen Analyse besitzt und durch Extraktion mit Dichlormethan im basischen und sauren Bereich aufgearbeitet wurde. Hierdurch wurden stark hydrophile Metabolite wie Glucuronide nicht erfasst. In wenigen Fällen wurden auch Urin und Leberproben analysiert. Für die HPLC-DAD- Messungen wurden Anlagen der Firma Shimadzu verwendet. Die Detektion erfolgte zwischen 195-380 nm mit einem Acetonitril/Phosphatpuffergemisch (pH=2,3) an RP8-Säulen. Es wurden zwei verschiedene LC-TOF-MS Geräte der Firmen Agilent und Waters mit einer Massengenauigkeit < 5 ppm verwendet. Für ergänzende Untersuchungen stand ein LC-QTOF-MS-Instrument der Firma Agilent zur Verfügung. Die Chromatographie erfolgte an einem Gradienten mit Fließmittel aus Methanol und wässriger Ameisensäure an einer C18 Säule. Die in-source ESI- CID Spektren wurden bei zwei unterschiedlichen Kollisionsenergien aufgenommen. Mit niedriger Energie wurden Spektren ohne Fragmentierung erhalten und mit hoher Energie mit Fragmentierung. Das Q-TOF/MS Instrument ermöglichte die Messungen der Massenspektren im MS sowie im MS-MS Modus. Insgesamt wurden Proben von 430 Todessfällen mit 47 Wirkstoffen analysiert, wobei diese Wirkstoffe mit einer Häufigkeit zwischen 1 und 90 in den Fällen vorkamen. Durch HPLC-DAD wurden von insgesamt 141 Metaboliten die UV-Spektren gemessen und die korrigierten relativen Retentionszeiten sowie die auf die Muttersubstanz bezogenen Retentionszeiten (QRRT-Werte) der Metabolite bestimmt. Durch LC-TOF/MS wurden insgesamt für 406 Metabolite die MS- und die MS-MS-Spektren gemessen und die relative Retentionszeit bestimmt. Von den 47 Wirkstoffen wurden in der schriftlichen Arbeit die Ergebnisse für die sechs Substanzen Amprenavir, Citalopram, Clozapin, Diphenhydramin, Flecainid und Ketamin ausführlich dargestellt. Ausgehend von den aus der Literatur bekannten Metabolisierungsschemata wurden zunächst die Ionenchromatogramme der Metabolite in den LC-TOF-MS- (bzw. den LC-QTOF-MS)-Files gesucht und mit Hilfe der exakten Massendifferenz konkreten Metabolisierungsprozessen (Desalkylierungen, Hydroxylierungen usw.) zugeordnet. Eine genauere Strukturzuordnung, insbesondere die Unterscheidung isomerer Metabolite wurde auf der Basis der Fragmentspektren versucht, die durch kollisionsinduzierte Dissoziation in der Ionenquelle (in-source CID) bei einstufigen Geräten oder in der Kollisionzelle des Q-TOF-Instrumentes erfolgte. Eine entscheidende Hilfe war dabei die Interpretation des Fragemtierungsverhalten der Metabolite im Vergleich zur Muttersubstanz. Alle Metabolite wurden durch Massenspektrum und Fragmentierungs-schemata eindeutig beschrieben. Als Kriterien der Zuordnung von chromatographischen Peaks zu bestimmten Metaboliten wurden das regelmäßige Auftreten bei Vergiftungen mit dem Ausgangwirkstoff, die charakteristische aus der Strukturänderung resultierende Retentionzeitverschiebungen gegenüber dem Ausgangwirkstoff, die mit LC-TOF/MS bestimmten akkuraten Molmassen mit der Massengenauigkeit des Precursers <5ppm und die Übereinstimmung des Isotopenverhältnisses von >90% sowie die Zuordnung der Hauptfragmente des MS-MS-Experiments herangezogen. Bei HPLC-DAD wurden die Identität oder die Ähnlichkeit der UV-Spektren mit dem Muttersubstanz, die relative Retentionszeit RT und der Retentionszeitquotient QRRT von Metabolit und Wirkstoff benutzt. Für die Zuordnung der Metabolite im HPLC-DAD- Chromatogramm wurde zusätzlich ein Vergleich mit dem LC-TOF-MS-Ergebnissen vorgenommen. Bei den beispielhaft beschriebenen Vergiftungsfällen zu diesen sech Wirkstoffen, besonders ausführlich für Diphenhydramin, wurde eine halbquantitative Bestimmung der Metaboliten-konzentrartionen vorgenommen und das Konzentrationsverhältnisses CMet/CWirkst,berechnet. Dieses Verhältnis wurde mit Angaben aus der Vorgeschichte und zum Zeitverlauf der Intoxikationen verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die auf den Ausgangwirkstoff bezogene Metabolitenkonzentration unter bestimmten Bedingungen eine Abschätzung der Überlebenszeit nach der Giftaufnahme gestattet. Für acht weitere Wirkstoffe (Amitriptylin, Levomeprazin, Mirtazapin, Quetiapin, Saquinavir, Sertralin, Venlafaxin, Verapamil) konnte im Rahmen dieser Arbeit lediglich ein kurzer Überblick über die festgestellten Metabolite ohne ausführliche Interpretation der Spektren gegeben werden. Schließlich wurden in einem zusammenfassenden Abschnitt auf der Basis der bei einzelnen Wirkstoffen festgestellten Ergebnisse die Kriterien für die Erkennung und Charakterisierung der Metaboliten mittels LC-TOF/MS im Vergleich zu den HPLC- DAD Ergebnissen für Desalkylierungen, oxidative Desaminierungen, Hydroxylierungen, Epoxidierungen, Oxidationen am Stickstoff und Schwefel sowie Dehalogenierungen diskutiert. Insgesamt führten die Untersuchungen zu dem Schluss, dass LC-TOF-MS und HPLC-DAD, insbesondere auch in Kombination, geeignete Methoden darstellen, die eine sichere Zuordnung von Metaboliten in der systematischen toxikologischen Analyse auch ohne Referenzsubstanzen gestatten. Die in den Fallproben mit beiden Methoden gemessenen und strukturell zugeordneten Spektren können in einer Datenbank als Vergleich für die Peakidentifikation in der Routine der toxikologischen Analyse dienen.

Metabolites play an important role in the analytical investigation and in the interpretation of drug poisonings. Hence, it was systematically examined in this thesis under the special methodological aspect of HPLC with photodiode array detector (HPLC-DAD) and liquid chromatography with time of flight mass spectrometry (LC-TOF-MS) to which extent an identification of metabolites in the practice of systematic toxicological analysis of deaths is possible. In the theoretical chapter of the work, the basics of drugs metabolism in human organism were shown, the physical and chemical principles of the methods used under the special aspect of the detection of metabolites were discussed and the literature on the topic was summarized, focusing on the relatively new LC- TOF-MS method. Blood was used as an essential sample material in this work, since it has generally the greatest importance in toxicological analysis. The blood samples were extracted with dichlormethane at alkaline and acidic pH. In this way, strongly hydrophilic metabolites such as glucuronides were not detected. In few cases, urine and liver samples were also analyzed. For the HPLC-DAD measurements, instruments of the company Shimadzu were used. The detection was between 195-380 nm with an acetonitrile/phosphate buffer mixture (pH=2.3) and with RP8 columns. Two different LC-TOF-MS equipments were used from Agilent and Waters, both with a mass accuracy <5 ppm. An LC-QTOF-MS instrument from Agilent was available for complementary tests. The chromatography was performed on a C18 column using a gradient elution with a mobile phase consisting of methanol and aqueous formic acid. The ESI in-source CID spectra were recorded at two different collision energies. Low-energy spectra were obtained without fragmentation and high energy spectra with fragmentation. The instrument Q-TOF/MS allowed the measurements of the mass spectra in MS and MS-MS mode. Altogether, samples from 430 death cases with 47 substances were analyzed, with a frequency of these substances in the cases between 1 and 90. The UV spectra of 141 metabolites were measured by HPLC-DAD, and the corrected relative retention times RRT as well as the retention times referred to the parent compounds (QRRT values) of these metabolites were determined. The MS and MS-MS spectra for a total of 406 metabolites were measured by LC-TOF/MS, and the relative retention times were also determined. From the 47 substances, the results for the six substances amprenavir, citalopram, clozapine, diphenhydramine, flecainide and ketamine were described in detail in the written thesis. Based on the biotransformation reactions known from literature, at first the ion- chromatograms of the metabolites were searched in the LC-TOF-MS files or the LC-QTOF-MS files, and were assigned to concrete biotransformation processes (dealkylation, hydroxylation. etc.) by aid the exact mass differences. A more precise structural identification, in particular the distinction of isomeric metabolites, was tried on the base of the fragment spectra which were generated by collision-induced dissociation in the ion source (in-source CID) of the single-stage instruments or in the collision cell of the Q-TOF instrument. In addition, crucial information was obtained from the interpretation of the fragmentation of the metabolites in comparison to parent substances. All metabolites were clearly characterized by mass spectrum and fragmentation schemes. The criteria of the attribution of chromatographic peaks to specific metabolites were the regular appearance in poisoning cases with the parent substance, the characteristic range of the retention time shifts resulting from the structural changes compared with the parent substance, accurate molecular masses of precursors with the mass accuracy <5 ppm which were measured by LC-TOF/MS, the agreement of the isotope ratio of > 90% as well as the interpretation of the main fragments of the MS- MS experiments. The attribution of the metabolites in HPLC-DAD chromatogram was supported by the identity or similarity of the UV spectra of the parent compound, the relative retention time RT and the retention time ratio QRRT of metabolite and parent substance. In addition, a comparison with the LC-TOF-MS results was carried out. In the exemplarily described poisoning cases to these six substances, especially detailed for diphenhydramine, a semi-quantitative determination of the metabolite concentrations was carried out and the concentration ratio CMetabolite/Cparent was calculated. This ratio was compared with data from the case history and with the time course of the intoxication. It could be shown that the metabolite concentration related to the parent substance under certain conditions permits an evaluation of the survival time after intake of the poison. For further eight substances (amitriptyline, levomeprazine, mirtazapine, quetiapine, saquinavir, sertraline, venlafaxine and verapamil) only a short overview about the identified metabolites could be given in this written thesis without detailed interpretation of the spectra. Finally, in a summarizing chapter, the criteria for identification and characterization of metabolites by LC-TOF/MS compared to HPLC-DAD were discussed for desalkylation, oxidative desamination, hydroxylation, epoxidation, oxidation at nitrogen and sulfur, as well as dehalogenation on the basis of the results obtained for the investigated drugs. Altogether, the investigations led to the conclusion that LC-TOF-MS and HPLC-DAD, especially in combination, represent suitable methods that permit a sure identification of metabolites in systematic toxicological analysis without reference substances. The structurally attributed spectra, which were measured with both methods in the samples of the cases, can serve in a database for the peak identification in the routine of the toxicological analysis.