In situ forming biodegradable microparticles for sustained parenteral delivery of protein drugs

Abstract

Lysozyme release from in situ forming delivery systems methodical aspects An in vitro dissolution methodology for the release of hen egg-white lysozyme from in situ forming biodegradable drug delivery systems was developed, which provided complete recovery of fully active material from protein solutions, which were stored up to 70 days at body temperature. An extraction methodology was developed, which facilitated complete recovery of fully active protein from organic solvents, PLGA solutions and in situ microparticle emulsions as well as from dried implants (with and without residual water). Deleterious conditions like water-organic solvent mixtures or interfaces were completely avoided. Non-aqueous precipitation of organic lysozyme solutions in DMSO showed that apparently native, reversible aggregates formed during the precipitation. The extraction of in situ microparticle formulations indicated, that the emulsification process, which was applied during manufacturing of oil-in-oil ISM, did not alter the protein integrity. Formulation parameters of in situ forming drug delivery systems Dissolution results obtained with in situ implants based on water-miscible polymer solvents suggested a complex, four-phasic release characteristic consisting of an initial diffusion- controlled phase followed by an erosion-controlled release phase, a phase with marginal release and a second erosion-controlled phase. The changes of the release pattern resulting from a variation of the lysozyme loading of the formulation suggested a three-compartment model of the total drug distribution. Accordingly, a novel mathematical description of the drug release behavior was derived, which combined a (semi-)empirical description of the diffusion-controlled drug release phase with a novel theoretical description of the PLGA erosion process. This composite model facilitated a good approximation of the actual lysozyme release characteristics and might be applicable to other drugs, which are preferentially released through degradative erosion of the polymer matrix. The release of lysozyme was always incomplete. Therefore, a selection of additives was screened for a positive effect on the recovery of lysozyme. Co-incorporation of PVP and protamine sulfate into in situ implant formulations resulted in an increase of the lysozyme fraction, recoverable during in vitro release testing. In case of the auxiliary protein protamine, a preferential release of lysozyme, due to a successful competition for adsorption to PLGA, could be concluded. Dissolution of lysozyme in DMSO and subsequent precipitation with PLGA and non-solvent (ethyl acetate or triacetin) facilitated incorporation of finely dispersed lysozyme into in-situ forming implants. Precipitated lysozyme showed full biological activity and a reduced particle size. Application as an in-situ precipitation step of protein dispersions in PLGA solutions could avoid costly or harmful protein micronization methods. The storage stability of lysozyme in PLGA solutions could also be improved by nonaqueous precipitation. Protein aggregation proceeded much faster with more lysozyme dissolved. Precipitated and dispersed lysozyme showed storage stability in PLGA solutions at ambient temperature for 98 days. The addition of parenterally applicable phospholipid derivatives to the external oil phase of in situ forming microparticles was found to be a promising stabilization approach for the oil-in-oil emulsions.

In vitro Freisetzung von Lysozym aus in situ Arzneiformen Methodische Aspekte Es wurde eine Methode zur Freisetzung von Lysozym aus sich in situ bildenden, bioabbaubaren Darreichungsformen entwickelt, welche sowohl die Konzentration als auch die biologische Aktivität des Modelproteins während der Inkubation bei 37°C für bis zu 70 Tage erhielt. Proteinadsorption an die Oberfläche von Partikeln aus wasserunlöslichem PLGA war der Hauptgrund für Lysozymverluste während der Inkubation mit typischen Formulierungsbestandteilen. Eine Extraktionsmethode wurde entwickelt, welche eine komplette Wiedergewinnung von nativem Lysozym aus nichtwässrigen Proteinlösungen und -suspensionen, in situ Implantaten, in situ Mikropartikelemulsionen und getrockneten Implantaten ermöglichte. Die nichtwässrige Präzipitation von Lysozym in DMSO führte zur Bildung von renaturierten Proteinaggregaten, welche sich in wässrigem Medium wiederauflösen ließen und volle Aktivität zeigten. Die vollständige Extraktion von nativem Lysozym aus Öl-in-Öl in situ Mikropartikelemulsionen zeigte, dass es zu keinen Verlusten oder irreversiblen Veränderungen des Proteins an der ausgebildeten Grenzfläche kam. Formulierungsparameter von proteinbeladenen in situ Arzneiformen In Übereinstimmung mit in situ Formulierungen basierend auf Triacetin (Nichtlösemittel für Lysozym), wurden mit DMSO (Lösemittel) Freisetzungsprofile mit vier unterschiedlichen Charakteristiken erhalten, eine diffusionskontrollierte initiale gefolgt von einer erosionskontrollierten Phase, eine Phase mit nur geringer Lysozymfreisetzung und schließlich eine wahrscheinlich zweite erosionskontrollierte Phase. Die Freisetzungscharakteristik konnte unter der Annahme einer Aufteilung der gesamten Lysozymbeladung auf drei verschiedene Kompartimente mathematisch beschrieben werden. Dabei wurde eine (semi-)empirische Beschreibung des Diffusionsvorgangs mit einem neuen theoretischen Model zur Beschreibung des Erosionsprozesses von PLGA kombiniert. Eine breitere Anwendung des mathematischen Models auf andere, vornehmlich durch Polymererosion freigesetzte Arzneistoffe wäre vorstellbar. Eine Steigerung der Freisetzung von Lysozym aus in situ Implantaten wurde durch die Einarbeitung der Hilfsstoffe Polyvinylpyrrolidon und Protaminsulfat erreicht, was für Protaminsulfat auf eine kompetitive Verdrängung von Lysozym von der PLGA- Oberfläche zurückgeführt werden konnte. Die Auflösung von Lysozym in DMSO mit nachfolgender Präzipitation durch Zugabe von PLGA und Protein-Nichtlösemittel (Ethylacetat oder Triacetin) ermöglichte die Einarbeitung von Lysozym als feinverteiltes Proteinpräzipitat in PLGA-Lösungen. Präzipitiertes Lysozym zeigte volle biologische Aktivität und eine reduzierte Partikelgröße. Die Anwendung der nichtwässrigen Proteinausfällung als Herstellungsschritt von bioabbaubaren Arzneiformen könnte damit eine aufwendige Mikronisierung von Proteinen erübrigen. Die Lagerstabilität von Lysozym in in situ Implantaten (PLGA-Lösungen) hing davon ab, wie das Protein in der Formulierung vorlag. Nur vollständig präzipitiertes und dispergiertes Lysozym waren stabil in PLGA Lösungen bei Raumtemperatur für 98 Tage. Zusammensetzung der externen Phase der in situ Mikropartikelemulsionen Eine Steigerung der Stabilität von Öl-in- Öl ISM-Emulsionen basierend auf DMSO konnte mit parenteral applizierbaren Phospholipiden erreicht werden.