Untersuchung des Einflusses eines nicht-viralen BMP-2-Gentransfers auf die Implantateinheilung am Kaninchenmodell: biomechanische Untersuchung

Abstract

Weltweit werden jedes Jahr über 2 Mio. Gelenke durch eine Total- oder Hemiendoprothese ersetzt. Nach Implantation einer Hüftendoprothese kommt es in den ersten drei Monaten zum Knochenverlust von bis zu 14%. In der Folge treten bei vielen Patienten Prothesenlockerungen oder Infektionen auf, die einen erneuten Eingriff unabwendbar machen. Wechseloperationen sind mit größerem Blutverlust, längerer Eingriffsdauer und einer Zunahme von Komplikationen verbunden, die auch die Mortalität erhöhen. Die demographischen Daten sprechen weltweit für eine Zunahme der Indikationen für Gelenkersatz. Schätzungen zufolge wird die Zahl der häufig benötigten Prothesenoperationen in Deutschland jährlich um 3-5% ansteigen. Ein volkswirtschaftlicher Kostenanstieg und die psychologische Belastung für die Patienten sind mögliche Folgen. Schlecht einheilende Prothesen, periprothetische Frakturen und Implantatlockerung mit anschließender Revision machen eine Optimierung der Implantateinheilung notwendig. Osteoinduktive Zytokine sind seit Urist‘ Entdeckung der BMPs erforscht worden. BMP-2 und BMP-7 sind klinisch zugelassen und werden als rekombinant hergestellte Proteine verabreicht. Ein anderer Ansatz in der Applikation ist die Gentherapie. Dazu wird das für den Wachstumsfaktor kodierende Gen in das Zielgewebe eingeschleust. Die Zellen exprimieren das therapeutische Protein unmittelbar im Zielgewebe und somit örtlich und zeitlich limitiert. Für die klinische Anwendung bei der unzementierten Endoprothetik wäre diese Form des Gentransfers optimal, da hauptsächlich der Peri-Implantatknochen als Zielgewebe betroffen ist und die unerwünschten Nebenwirkungen reduziert werden könnten. In der Gentherapie werden die nicht-viralen Vektoren kontinuierlich verbessert. Eine Neuentwicklung sind sogenannte COPROGs. Dabei wird die DNA, kodierend für den Wachstumsfaktor BMP-2, mit dem häufig verwendeten PEI (Polyethylenimin) komplexiert und von einem Schutzpolymer umhüllt. In einer tierexperimentellen Studie wurden 64 Kaninchen (New Zealand White Rabbit) in 4 Gruppen aufgeteilt und beidseitig an der Tibia mit Implantation eines Titannagels operiert. Gruppe I galt als Kontrollgruppe mit einfacher Implantation des Titannagels. Gruppe II war die erste Versuchsgruppe mit zusätzlicher Fibrinkleberapplikation. Gruppe III stellte die zweite Versuchsgruppe dar mit Implantatimplantation und kombinierter Fibrinkleber- BMP-2-Plasmid Applikation. Für die Sicherheitsuntersuchung, d.h. insbesondere zum Ausschluss einer systemischen Transfektion, diente die Gruppe IV. Einziger Unterscheid zur Gruppe III war, dass das Plasmid für ein Reportergen anstelle von BMP-2 kodiert. Untersucht wurden in den Gruppen I-III zwei Behandlungszeiträume, 28 oder 56 Tage. In der Gruppe IV gab es vier Untersuchungszeitpunkte, 3,7,28 oder 56 Tage. In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse der biomechanischen Untersuchungen der Tiere aus den Gruppen I-III vorgestellt. Dazu wurde der push-out Test verwendet. Es erfolgte eine zusätzliche Bestimmung der Blut- und Serumparameter bei allen Tieren und eine radiographische Analyse der postoperativ und post mortem erstellten Röntgenbilder. Die statistisch ausgewerteten Daten zeigten eine signifikante Zunahme der Implantateinheilung in der Kontrollgruppe von Tag 28 zu Tag 56. Dies war auch bei der BMP-Plasmid Gruppe zu erkennen, jedoch war wie bei der Fibringruppe der Unterscheid von Tag 28 zu Tag 56 nicht signifikant. Der Vergleich der Gruppen untereinander zeigte keinen signifikanten Einheilungsunterschied zwischen der Kontroll- und der Fibringruppe an beiden Untersuchungszeiträumen. Die BMP-2-Applikation resultierte in einer verminderten biomechanischen Festigkeit des Implantats im Knochen beim push- out Test. Die Auswertung der Röntgenbilder zeigte eine generelle Zunahme der Knochendicke, die jedoch nicht mit der biomechanischen Festigkeit korrelierten Die bestimmten Blut- und Serumparameter blieben gruppenübergreifend im Verlauf unauffällig. Bedeutsam war die durch den Nachweis des Reportergens in verschiedenen Organen gewonnene Erkenntnis, dass eine systemische Transfektion stattgefunden hatte. Dieser Aspekt muss Gegenstand weiterer Forschung sein. Möglicherweise wurde der Fibrinkleber inklusive BMP-2 Genvektor durch den intramedullären Druck bei der Applikation des Implantats in den Markraum aus diesem herausgepresst und konnte sich über die Blutbahn systemisch verteilen. Die prinzipielle Anwendbarkeit von Fibrinkleber wurde gezeigt, da kein retardierender Effekt auf die Einheilungsdauer und keine verminderte Festigkeit festgestellt wurde. In diesem Versuch war der Gentransfer des BMP-2 Plasmids im neu entwickelten nicht-viralen Vektor mit Fibrinkleber als Trägermaterial zwar erfolgreich, brachte jedoch keine biomechanischen Vorteile. Im Gegenteil zeigten die biomechanischen Resultate, dass das Implantat in der BMP-2-Versuchsgruppe verglichen mit der Fibrin Versuchsgruppe und der Kontrollgruppe deutlich schlechter inkorporiert wurde. Diese Erkenntnis kontrastiert das bisherige Verständnis der biologischen Wirkung von BMP-2, einem Protein mit stark osteoinduktivem Potential. In der Frakturheilung zeigen BMPs eine deutliche Stimulation der Heilungsprozesse. Eine mögliche Erklärung für den negativen Effekt von BMP-2 bei der Implantateinheilung könnte eine unterschiedliche Knochenbildung sein. Im vorliegenden Im vorliegenden Versuch geschah das Knochenwachstum direkt um das Implantat, anders als im Frakturmodell, wo Knochenbildung über die Zwischenstufe der Knorpelbildung geschieht. Die Ergebnisse der noch nicht abgeschlossenen histologischen Untersuchung werden weitere Erkenntnisse bringen und das Bild vervollständigen. Um die komplexe biologische Wirkung von BMP-2 auf die Knochenheilung und die ihr zugrunde liegenden Mechanismen aufzuschlüsseln, bedarf es weiterer Forschung mit dem Ziel, neue und sichere Behandlungsstrategien für die klinische Anwendung zu entwickeln.

More than 2 million joint are replaced each year by use of a total- or hemi endoprosthesis. Up to 14% of bone substance is lost after implantation. Consecutive periprosthetic fractures, infections or implant loosening is a possible consequence. Revision of the prosthesis implies a greater surgical risk with possible blood loss and higher mortality. Demographic data shows an increased need for operations involving the replacement of joints. Recombinant growth factors are frequently used in research and clinical application or regeneration of tissues and cells. Since the genetic code of most growth factors is known, genetic manipulation of cells in order to express a certain growth factor, is an attractive alternative tot he application of recombinant growth factors. Not only for economic reasons but also to maintain a constant level of an effective dosis of the protein over a longer time period by only one application. The effect of locally applied plasmids encoding for Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) on implant ingrowth was studied. A non-viral vector and fibrin glue as carrier was used in a non weight bearing model. 48 animals were divided in 2 groups with postoperative time periods of 28 (A) and 56 days (B). Each group consisted of 3 subgroups (SG 1-3 A/B, 8 animals each), each receiving a different application. In anaethsia both tibiae of the animals were reamed in anterograde direction. The reamed tibiae were not filled in the first subgroup(SG 1), filled with fibrin glue (SG 2) or filled with fibrin glue plus a copolymer protected gene vector (COPROG) carrying the BMP-2 encoding plasmid (SG 3). After filling the tibia a titanium nail diameter was inserted in anterograde direction. The the position was then controlled radiographically. A further 12 rabbits received fibrin glue carrying COPROG combined in this case with the Luciferase marker-gene, as part of a safety study. They also were divided in subgroups. After 28 and 56 days (4, 7 and 28 days in the marker-gene group respectively) animals were sacrificed. Both tibiae were explanted, one for histological analysis (not part of this dissertation), the other one for biomechanical testing. For biomechanical testing we used an approved push out device4 to measure the peak force needed to loosen the nail from the bone. The peak force was set in ratio to the largest possible area of the bone-implant interface. In the marker gene groups (not part of this dissertation) the bone was opened and the endosteum removed for testing using an ELISA assay. Additional Specimens were taken from brain, lung, liver, testicles and muscle tissue. Statistical tests were conducted using the Mann-Whitney-U-Test. The results of the biomechanical testing showed significantly lower shear strength in subgroup 3 at both timepoints. The difference between group 1and 2 was not significant in either of the timepoints. In the histological analysis the fibrin/BMP-2-plasmid group showed less bone-implant contact than both other groups and thus support the results of the biomechanical testing. In the additional safety study traces of the Luciferase marker gene were found in 22/24 tibiae at all timepoints. 15/72 specimens of ectopic organs were also positive. A preference could be found for lung and testicles. Muscle tissue was affected least. In this investigation it could be proven that a gene transfer using the non-viral gene vector COPROG and fibrin glue as a carrier works. Anyway the biomechanical and histological results showed signifigantly less implant incorporation when a BMP-2 plasmid was used compared to the two control groups and one fibrin group. These findings are in contrast to the presently preexisting notion that BMP-2 has a strong osteogenic potential. In the literature hardly any clinical experience exists for BMP-2 to support implant incorporation. The inhibitory effect might be model-related but could as well indicatecurrently unknown effects of BMP-2. One explanation might be, that these effects could be based upon the different mechanisms of bony implant incorporation where bone is formed directly without formation of cartilage and fracture healing where bone develops secondary from cartilage tissue. Which is supported by data showing greater expression of BMP-2 in a cartilage than a bone environment. The positive testing for Luciferase in organs outside the local application demand further investigation. It can be hypothesized that fibrin glue carrying the vector entered the blood vessels due to the increased intramedullary pressure during application of the nail. To further elucidate the mechanisms underlying the promotion of bone formation more research is needed. The molecular characterization of the BMP-2 signal transduction cascade could yield more knowledge about how to safely and effectively use therapeutic gene therapy in impleant growth.