Hydrophobe Metabolite der Urämie: Proteinaffinität, Quantifizierung und methodische Ansätze zur Untersuchung vaskulärer Effekte

Abstract

Etwa 11 % der Bevölkerung leiden an chronischer Niereninsuffizienz. Im Rahmen dieser Erkrankung ist die Eigenschaft des Plasmaproteins Albumin zum Transport hydrophober Liganden, wie Urämietoxinen, Medikamenten und Stoffwechselmetaboliten beeinträchtigt, ohne dass die zugrundeliegenden Mechanismen bisher vollständig aufgeklärt sind. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit nach Ursachen für die verringerte Bindungskapazität des Albumins chronisch-niereninsuffizienter Patienten gesucht. Im ersten Abschnitt dieser Dissertation wurde Albumin aus Plasma nierengesunder Probanden und chronisch-niereninsuffizienter Patienten isoliert, massenspektrometrisch analysiert und in Bezug auf die Bindung zweier repräsentativer Liganden, Indoxylsulfat und Tryptophan, charakterisiert. Die Untersuchung zeigte, dass Albumin chronisch-niereninsuffizienter Patienten guanidinyliert vorliegt und sich diese pathologische posttranslationale Modifikation negativ auf die Bindungskapazität hydrophober Metabolite auswirkt. Hydrophobe Urämietoxine können auf Grund ihrer Albuminbindung nur schwer durch extrakorporale Dialyseverfahren entfernt werden und haben zudem einen entscheidenden Anteil an der vermehrten Entstehung kardiovaskulärer Erkrankungen bei chronischer Niereninsuffizienz. Daher wurde im zweiten Abschnitt der Dissertation eine Methode entwickelt, um den freien Anteil hydrophober Urämietoxine im Plasma zu erhöhen und so eine verbesserte Entfernung während der Hämodialyse zu erreichen. Sowohl eine Verdünnung des Plasmas als auch eine Erhöhung von Ionenstärke sowie der Temperatur führte zu einer Erhöhung des freien Anteils an Indoxylsulfat. Gegenstand des dritten Abschnitts der Dissertation war die Etablierung eines in-vitro-Perfusionsmodells einer künstlichen Arterie, um Interaktionen und metabolische Funktionen von Mediatoren, Urämietoxinen oder auch posttranslational modifiziertem Albumin auf das vaskuläre System untersuchen zu können. Die Funktionalität und Validität eines derartigen Modells wurde mittels verschiedener Assays dargestellt. Die vorliegende Dissertationsschrift hat damit die Basis geschaffen, guanidinyliertes Albumin chronisch-niereninsuffizienter Patienten als potentiellen Biomarker der chronischen Niereninsuffizienz zu verwenden. Die Methode zur Erhöhung des freien Anteils proteingebundener Urämietoxine kann deren Entfernung durch Hämodialyse verbessern und dadurch zu einer Verringerung von Morbidität und Mortalität chronisch-niereninsuffizienter Patienten beitragen. Des Weiteren stellt die künstliche Arterie mit den in dieser Studie verwendeten Assays und Endpunktanalysen ein validiertes in-vitro-Modell zur Testung von Mediatoren bzw. pathophysiologischen Metaboliten und deren Auswirkungen auf das vaskuläre System dar und ist als Ersatz für einige Tiermodelle denkbar.

Approximately 11 % of the population is affected by chronic kidney disease. In the context of this disease the property of the plasma protein albumin is impaired for the transport of hydrophobic ligands such as uremic toxins, drugs and metabolites. The underlying mechanisms are not completely understood to date. Therefore, in the present work we investigated the causes of the reduced binding capacity of albumin from patients with chronic kidney disease. In the first part of this thesis, albumin was isolated from plasma of control subjects and patients with chronic kidney disease, analyzed by mass- spectrometry and characterized with respect to the binding of two ligands (indoxyl sulfate and tryptophan). The study showed that albumin from patients with chronic kidney disease is guanidinylated and this post-translational modification adversely affects the binding capacity of hydrophobic metabolites. Hydrophobic uremic toxins can be poorly removed by extracorporeal renal replacement therapies due to their albumin binding and they moreover have a critical role in the development of cardiovascular disease in chronic kidney disease. Consequently, a method was developed in order to increase the free fraction of hydrophobic uremic toxins in the plasma and to achieve improved removal during hemodialysis. Both, a dilution of the plasma and an increase of ionic strength as well as increased temperature, resulted in an increase of the free fraction of indoxyl sulfate. Subject of the third section of the thesis was the development and establishment of an in-vitro-artificial artery perfusion model to study interactions and metabolic functions of mediators, vascular damaging uremic toxins, or post-translationally modified albumin on the vascular system. The functionality and validity of such a model was demonstrated by various assays. The results of this thesis have set up the basis to use guanidinylated albumin as a potential biomarker for the chronic kidney disease. In addition, the developed methods for increasing the free fraction of protein-bound uremic toxins may increase their removal by hemodialysis and may thus contribute to a reduction of morbidity and mortality of patients with chronic kidney disease. Furthermore, the artificial artery developed in this study is now a validated in-vitro-model for testing mediators or pathophysiological metabolites and their effects on the vascular system and is suitable to replace animal models.