Rolle des Endothelin-Konversion-Emzym-Gens in der genetischen Prädisposition der essentiellen Hypertonie

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, den Promotor und die gesamte kodierende Region des ECE-1b-Gens als potentielles Kandidatengen der Blutdruckregulation auf genetische Polymorphismen und anschließend mögliche Assoziationen mit Blutdruckphänotypen zu untersuchen. In Funktionsanalysen sollte eine mögliche Funktionalität der identifizierten Polymorphismen untersucht werden. Es wurden 704 Hypertoniker kaukasischen Ursprungs rekrutiert. Für das systematische Mutationsscreening des ECE-1-Gens mittels SSCP-Analyse wurde die genomische DNA von 95 ausgewählten Hypertonikern verwendet. Die genaue Lokalisation der genetischen Variante erfolgte anschließend durch die Sequenzierung der DNA- Probe. Es konnten fünf doppelallelige ECE-1b Varianten identifiziert werden. Zwei lagen in der 5´-Region (Promotor): T-839G und C-338A. Die weiteren 3 Varianten lagen in verschiedenen Exons: L75F C/T (Exon 3), A677V C/T (Exon 17) und C+295T (Exon 19). Die Varianten in Exon 3 und 17 führten jeweils zu einem Aminosäureaustausch. Die Variante im Exon 19 lag im nicht mehr translatierten Bereich. Die identifizierten genetischen Varianten wurden auf die Häufigkeit des Auftretens in der Studienpopulation untersucht. Dazu dienten zwei Methoden, der Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus und die Hybridisierung mit allelspezifischen Oligonukleotiden. Die drei in Exons gelegenen Varianten waren so selten (<1%), dass in den folgenden Analysen nur die beiden im Promotor liegenden Varianten untersucht wurden. In der einzelnen Betrachtung beider identifizierten Promotorpolymorphismen waren beide Varianten statistisch signifikant mit 24-Stunden-Blutdruckwerten bei nicht antihypertensiv behandelten Frauen assoziiert, wobei die beiden mutierten Allele -839G und -338A jeweils mit erhöhten systolischen und diastolischen Blutdruckmittelwerten einhergingen. In den Haplotyp-Analysen zeigte sich ebenfalls ein statistisch signifikanter Zusammenhang zu den 24-Stunden- Blutdruckwerten bei den nicht behandelten Frauen, wobei der mutierte Haplotyp mit erhöhten systolischen und diastolischen Blutdruckmittelwerten assoziiert war. In den nachfolgenden Transfektions-Experimenten in Endothelzellen zeigten die Konstrukte mit dem -338A-Allel (-338A/-839T und -338A/-839G) verglichen mit dem Wildtyp-Konstrukt (-338C/-839T) eine erhöhte Promotoraktivität (130% und 136%), wobei beim -338A/-839G-Haplotypen die Erhöhung der Aktivität statistisch signifikant war (P=0.02). Mit Hilfe der TRANSFAC-Datenbank konnten für das -338A-Allel Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren aus der E2F- Familie identifiziert werden. Das -338C-Allel wies hingegen eine Bindungsstelle für GATA-Proteine auf. In den durchgeführten EMSAs mit den spezifischen Oligonukleotiden (ODNs) -338A und -338C und Zugabe von spezifischen Antikörpern konnte die Bindung von Transkriptionsfaktor E2F-2 für beide genannten Promotorsequenzen gezeigt werden. Zusätzliche Experimente mit quantitativer Auswertung der Bandenintensitäten zeigten eine erhöhte E2F-2-Bindungsaffinität des -338A-Promotorallels. Zusammenfassend konnte in den Untersuchungen ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen den beiden neu identifizierten Polymorphismen im Promotorbereich des ECE-1b-Gens und einem erhöhten arteriellen Blutdruck gezeigt werden. Unterstützt wird diese Feststellung durch die Ergebnisse der Funktionsanalysen, in denen der identifizierte ECE-1b C-338A Promotorpolymorphismus eine unterschiedliche allelabhängige Bindungsaffinität des Transkriptionsfaktors E2F-2 an den ECE- 1b-Promotor aufwies und zu einer erhöhten Promotoraktivität führte. Es konnte aufgrund dieser Ergebnisse die angenommene Bedeutung des ECE-1b-Gens als Kandidatengen in der Genese der essentiellen Hypertonie bestätigt werden.

The endothelin-converting enzyme (ECE)-1 gene is a candidate for human blood pressure (BP) regulation and we report the identification of the new gene variants T-839G, C-338A, L75F, A677V and C-295T. Transient transfection of the reporter constructs containing the -338A allele showed an increase in promoter activity compared with the wild-type promoter. EMSA revealed the specific binding of E2F-2 to both ECE-1b promoter sequences, with the -338A allele being associated with an increased affinity to E2F-2 compared with -338C. The clinical relevance of this finding was analyzed in 704 hypertensive patients. In untreated hypertensive women, both the -338A and -839G alleles were significantly associated with ambulatory BP values. This study provides the first evidence of a link between the cell-cycle-associated E2F family and BP regulation via a component of the endothelin system.