Molecular diagnosis and characterization of ticks and tick-borne pathogens infecting cattle in Mymensingh district of Bangladesh

Abstract

Tick-borne diseases (TBDs) affect the majority of world’s cattle population and are considered a major constraint to the health and productive performance of profitable livestock production throughout the world. Bovine anaplasmosis, babesiosis and theileriosis are the most economically important and widely distributed TBDs affecting cattle and are also endemic in Bangladesh. However, detailed information on the prevalence of bovine tick-borne pathogens (TBPs) determined using sensitive and specific molecular diagnostic tools is scarce for this country. The main objective of this cumulative thesis therefore was to investigate the prevalence of TBPs from blood samples collected from local cattle in Mymensingh district of Bangladesh using a Reverse Line Hybridization (RLB) assay. The first study aimed to estimate the prevalence of TBP´s in cattle of Mymensingh districct of Bangladesh. In total, 384 blood samples from apparently healthy cattle from 12 sub-districts (Upazilas) of Mymensingh district were spotted on FTA cards in the field and subsequently screened using a Reverse Line Blot (RLB) hybridization assay for the presence of Anaplasma, Ehrlichia, Rickettsia, Babesia and Theileria spp.. Rhipicephalus microplus and Haemaphysalis bispinosa were the main tick species infecting the examineed cattle. In the blood samples, Theileria orientalis infections were most frequently found (212/384, 55.2%) followed by infections with Anaplasma bovis (137/384, 35.67%), Anaplasma marginale (16/384, 4.17%), Babesia bigemina (4/384, 1.04%) and Babesia bovis (2/384, 0.52%). Two previously uncharacterized tick-borne pathogens (TBPs) were also found and further characterized. This included a novel Anaplasma sp. (Anaplasma sp. Mymensingh) and Babesia sp. (Babesia sp. Mymensingh) with estimated prevalences of (50/384, 13.0%) and (1/384, 0.3%). A phylogenetic analysis demonstrated that these newly described pathogens are genetically closely related to Anaplasma platys and Babesia bigemina, respectively. Several key risk factors e.g. access to grazing land, mud-made cattle house, tick infestation and presence of other TBDs were also identified on the prevalence of T. orientalis, A. marginale and Anaplasma sp. Mymensingh. A previously described inexpensive and in-house prepared ECL solution for Western blots was successfully adapted for use within the RLB assay and used in this study. These findings contribute to our knowledge on the occurrence of TBPs in Bangladesh and provide us with a better understanding of the epidemiology of ticks and TBPs, which will be helpful in the development of control strategies to limit the impact of TBPs. The second study aimed to elucidate the phylogenetic relationship between R. microplus ticks collected from Bangladesh, Myanmar and Pakistan with other Rhipicephalus spp. using Scanning Electron Microscopic (SEM) imaging and mitochondrial genome sequence analyses. Boophilid ticks are classified in the genus Rhipicephalus and are widely distributed in subtropical and tropical countries. Rhipicephalus microplus, also known as the common cattle tick, is the most important representative of the Rhipicephalus microplus complex. This complex is composed of several species that share many morphological similarities, complicating their identification. This one-host tick account for a significant economic losses to the livestock industry by causing irritation and blood loss, decreasing leather quality and acting as vectors for potentially fatal diseases such as bovine anaplasmosis and bovine babesiosis. However, little is known about the morphology and genetic background of R. microplus from Asia. Phylogenetic analyses of cytochrome oxidase 1 (cox1), internal transcribed spacer 2 (ITS-2) and 12S rRNA gene sequences confirmed that the R. microplus complex consists of at least five independent taxa. This includes R. annulatus, R. australis, R. microplus clade A sensu Burger et al. (2014), R. microplus clade B sensu Burger et al. (2014) and R. microplus clade C sensu Low et al. (2015). Rhipicephalus microplus ticks from Bangladesh, Myanmar and Pakistan were all assigned to R. microplus clade C. Furthermore, we confirmed that the cox1 gene was the preferred genetic marker for resolving the evolutionary relationships among closely related species within the R. microplus complex. SEM images of adult specimens from R. microplus clade C revealed a wide range of intraspecific morphological variations, including the features previously identified as critical for distinguishing R. microplus clade A from R. australis ticks, which is illustrative for the complications in identifying species within the R. microplus complex solely relied on the morphology. The results from this study highlight the need for more genetic sampling of the R. microplus complex from a wider geographical range and crossbreeding experiments between the different taxa or comparison of populations using nuclear genome data after deep sequencing to elucidate the species status of R. microplus clades.

Von Zecken übertragene Krankheiten (TBDs) betreffen den Großteil der weltweiten Rinderpopulation und werden als einer der größten negativen Einflüsse auf die Gesundheit und die produktive Leistungsfähigkeit der wirtschaftlichen Nutztierproduktion weltweit gesehen. Die Bovine Anaplasmose, Babesiose und Theileriose sind die wirtschaftlich am wichtigsten und am weitesten verbreiteten TBDs, die Rinder beeinträchtigen können. Sie sind auch endemisch in Bangladesch. Es fehlen jedoch detaillierte Informationen zur Prävalenz von Zecken übertragenen bovinen Pathogenen bei Rindern in Bangladesch. In der ersten Studie dieser Dissertation sollte daher die Prävalenz von TBP´s in Blutproben von Rindern im Distrikt von Mymensingh bestimmt werden. Insgesamt wurden 384 Blutproben von klinisch gesunden Rindern von 12 Sub-Distrikten (Upzilas) des Mymensingh Distrikts im Feld auf FTA-Karten aufgetragen und anschließend mittels eines Reverse Line Blot (RLB) Hybridisierung Assays auf das Vorhandensein von Anaplasma, Ehrlichia, Rickettsia, Babesia and Theileria spp. getestet werden. Rhipicephalus microplus und Haemaphysalis bispinosa waren die Hauptzeckenarten, die die untersuchten Rinder befallen hatten. In den Blutproben wurden am häufigsten Theileria orientalis-Infektionen nachgewiesen (212/384, 55.2%), gefolgt von Infektionen mit Anaplasma bovis (137/384, 35.67%), Anaplasma marginale (16/384, 4.17%), Babesia bigemina (4/384, 1.04%) und Babesia bovis (2/384, 0.52%). Auch zwei zuvor nicht bestimmte von Zecken übertragene Pathogene (TBPs) wurden gefunden und weiter charakterisiert. Dazu gehörten zwei neue Spezies, Anaplasma sp. (Anaplasma sp. Mymensingh) und Babesia sp. (Babesia sp. Mymensingh), mit geschätzten Prävalenzen von (13.0 %, 50/384) und ( 0.3 %, 1/384). Eine phylogenetische Analyse zeigte, dass diese neu beschriebenen Pathogene genetisch nah verwandt mit Anaplasma platys, beziehungsweise Babesia bigemina sind. Mehrere Risikofaktoren für das Auftreten von T. orientalis, A. marginale und Anaplasma sp. - Infektionen in Mymensingh wurden ebenfalls identifiziert, z.B. der Zugang zu Weiden, die Aufstallung in Lehmhäusern/-stallungen, hoher Zeckenbefall und das Vorhandensein anderer TBDs. Eine zuvor beschriebene kostengünstige und hausintern hergestellte ECL-Lösung für Western Blots wurde erfolgreich für den Gebrauch im RLB Assay angepasst und in dieser Studie benutzt. Diese Befunde tragen zu unserem Wissen über das Vorkommen von TBPs in Bangladesch bei und verschaffen uns ein besseres Verständnis über die Epidemiologie der Zecken und der TBPs, was hilfreich für die Entwicklung von Bekämpfungsstrategien sein wird, um die Auswirkungen von TBPs einzuschränken. Ziel der zweiten Studie war es, die phylogenetische Beziehung zwischen R. microplus-Zecken, die in Bangladesch, Myanmar und Pakistan gesammelt wurden, und anderen Rhipicephalus spp. mittels rasterelektronenmikroskopischer (REM) Bildgebung und mitochondrialen Genomsequenzanalysen zu erklären. Zecken des Subgenus‘ Boophilus werden unter dem Genus Rhipicephalus eingeordnet und sind weit in den subtropischen und tropischen Ländern verbreitet. Rhipicephalus microplus, auch als die gemeine Rinderzecke bekannt, ist der wichtigste Stellvertreter des Rhipicephalus microplus-Komplexes. Dieser Komplex besteht aus mehreren Spezies, die viele morphologische Gemeinsamkeiten haben, was ihre Identifikation erschwert. Diese einwirtige Zecke ist der Grund für signifikante wirtschaftliche Einbußen in der Nutztierindustrie, indem sie Irritation und Blutverlust hervorrufen und die Lederqualität reduzieren kann und indem sie als Vektor für potentiell tödliche Erkrankungen wie die bovine Anaplasmose und Babesiose agiert. Über die Morphologie und den genetischen Hintergrund von R. microplus aus Asien ist jedoch wenig bekannt. Phylogenetische Analysen der Cytochromoxidase 1 (Cox 1), des internal transcribed spacer 2 (ITS-2) und der 12S rRNA Gensequenzen bestätigen, dass der R. microplus-Komplex aus mindestens fünf unabhängigen Taxa besteht. Diese beinhalten R. annulatus, R. australis, R. microplus Klade A sensu Burger et al. (2014), R. microplus Klade B sensu Burger et al. (2014) and R. microplus Klade C sensu Low et al. (2015). Rhipicephalus microplus-Zecken aus Bangladesh, Myanmar und Pakistan wurden alle der R. microplus Klade C zugeordnet. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass das Cox 1-Gen der bevorzugte genetische Marker war, um die evolutionären Beziehungen zwischen den nah verwandten Spezies innerhalb des R. microplus-Komplexes zu erklären. REM-Bilder von adulten Exemplaren der R. microplus Klade C zeigten eine große Bandbreite intraspezifischer morphologischer Variationen, die auch Merkmale beinhalteten, die zuvor als ausschlaggebend für die Unterscheidung der R. microplus Klade A von R. australis-Zecken identifiziert worden waren. Dies veranschaulicht noch einmal die Komplikationen, die sich bei der nur auf Morphologie basierenden Identifikation der Arten innerhalb des R. microplus-Komplexes ergeben. Die Ergebnisse der Studie unterstreichen die Notwendigkeit, den R. microplus-Komplex aus einem größeren geographischen Bereich genetisch zu beproben und Kreuzungsversuche zwischen den verschiedenen Taxa durchzuführen oder Populationen mittels nuklearer Genomdaten nach einhergehender Sequenzierung zu vergleichen, um den Spezies-Status der R. microplus-Kladen aufzuklären.