Molecular analysis of ESBL-producing Escherichia coli from different habitats discloses insights into phylogeny, clonal relationships and transmission scenarios

Abstract

Clinically relevant extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing multi- resistant Escherichia (E.) coli are increasingly detected in various habitats, not only in a human and veterinary clinical context but also in extra-clinical settings such as communities, the environment and wildlife. Infections including diarrhea, septicemia, pneumonia, and wound and urinary tract infections these bugs cause are not only severe but also difficult to treat due to limitations in antimicrobial therapy possibilities. This thesis is based on a total of 100 samples from environmental dog feces and 320 cloacal samples from wild birds, which were collected in Berlin, Germany, between 2008 and 2014. Of these 10 % (dogs) respectively 7.5 % (birds) harbored ESBL- producing E. coli. In addition, eleven canine clinical and 40 human clinical (bacteremia) ESBL-producing E. coli isolates from the same area were included and pheno- and genotypically analyzed. To determine the phylogenetic population structure of ESBL-producing isolates, multi-locus sequence typing (MLST) was performed. The sequence type (ST) occurring in all sample groups was ST410. All ST410 isolates were initially clonally analyzed using pulsed- field gel electrophoresis (PFGE). Ten isolates from one clonal PFGE group with identical or almost identical macrorestriction patterns were then chosen for whole-genome sequencing using the MiSeq platform (Illumina). Following raw data reprocessing through standard bioinformatics pipelines it was possible to perform detailed phylogenetic and clonal as well as molecular analyses, again including both chromosomal and episomal (plasmids) determinants. Besides ST410, various sequence types frequently described in both humans and animals worldwide were detected in environmental dog feces and wild birds (ST10, ST131, ST224) with all isolates harboring the typical beta-lactamase (bla)-gene blaCTX-M-1 or blaCTX-M-15. Within the ten ST410 strains from different hosts in the same region, almost genetically identical isolates were identified. As some of the isolates differed by a few single-nucleotide polymorphisms (SNPs) only, the study gives initial evidence for an ongoing interspecies transmission of a putative successful new E. coli clone of ST410 between avian wildlife, humans, companion animals and the environment. This underlines the zoonotic potential of ESBL-producing E. coli as well as the mandatory nature of the One Health approach to address the threat of antimicrobial resistance. Future investigations call for long-scale and comprehensive epidemiological studies and functional analyses to reinforce the proposed transmission scenarios and to identify infection sources and underlying molecular mechanisms of successful pandemic clones.

Klinisch relevante extended-Spektrum beta-Laktamase-bildende multi-resistente Escherichia (E.) coli werden zunehmend in verschiedenen Milieus detektiert, nicht nur in einem human- und veterinärmedizinischen Kontext, sondern auch in extra-klinischen Umfeldern wie in der Gesellschaft, in Wildtieren und in der Umwelt. Infektionen, einschließlich Diarrhoe, Septikämie, Pneumonie sowie Wund- und Harnwegsinfektionen, welche diese Bakterien verursachen, sind nicht nur schwerwiegend, sondern durch die Einschränkungen bei antimikrobiellen Therapiemöglichkeiten auch schwierig zu behandeln. Diese Doktorarbeit basiert auf insgesamt 100 Proben aus Umwelthundekot und 320 Kloakenproben aus Wildvögeln in Berlin, Deutschland, die zwischen 2008 und 2014 gesammelt wurden. Von diesen trugen 10 % (Hunde) beziehungsweise 7.5 % (Wildvögel) ESBL- bildende E. coli. Zusätzlich wurden elf Hunde-klinische und 40 humane klinische (Bakteriämie) ESBL-bildende E. coli Isolate aus derselben Region berücksichtigt und pheno- und genotypisch charakterisiert. Um die phylogenetische Populationsstruktur der ESBLbildenden Isolate zu bestimmen, wurde eine Multilokus Sequenztypisierung (MLST) durchgeführt. Der in allen Probengruppen vorkommende Sequenztyp (ST) war ST410. Alle ST410 Isolate wurden zunächst mittels Pulsfeld Gelelektrophorese (PFGE) klonal analysiert. Zehn Isolate aus einer klonalen PFGE Gruppe mit identischen oder fast identischen Makrorestriktionsmustern wurden dann für eine Gesamtgenomsequenzierung mittels MiSeq Plattform (Illumina) ausgewählt. Folgend einer Neubearbeitung von Rohdaten durch standardisierte bioinformatische Pipelines war es möglich, detaillierte phylogenetische und klonale sowie molekulare Analysen durchzuführen, wieder unter Einschluss von sowohl chromosomalen als auch episomalen (Plasmide) Determinanten. Neben ST410 wurden verschiedene Sequenztypen, die häufig sowohl in Menschen als auch Tieren weltweit beschrieben sind, in Umwelthundekot und Wildvögeln detektiert (ST10, ST131, ST224). Alle Isolate enthielten das typische beta-Laktamase (bla)-Gen blaCTX-M-1 oder blaCTX-M-15. Innerhalb der zehn ST410 Stämme aus verschiedenen Wirten in der gleichen Region wurden fast genetisch identische Isolate identifiziert. Da sich manche der Isolate nur in einigen Einzelnukleotid Polymorphismen (SNP) unterschieden, gibt diese Studie einen ersten Hinweis auf eine permanente Inter-Spezies Transmission von mutmaßlich erfolgreichen neuen E. coli Klonen von ST410 zwischen aviären Wildtieren, Menschen, Haustieren und der Umwelt. Dies unterstreicht das zoonotische Potential von ESBLproduzierenden E. coli sowie die dringende Notwendigkeit des One Health Ansatzes, um die Gefahr der antimikrobiellen Resistenz anzugehen. Zukünftige Untersuchungen erfordern groß angelegte und umfassende epidemiologische Studien und funktionelle Analysen, um die hier unterbreitete Aussage über Transmissionsszenarien zu bekräftigen und um zugrundeliegende molekulare Mechanismen von erfolgreichen pandemischen Klonen zu identifizieren.