Evaluation of the plastidic antioxidant system in Jatropha curcas and Swietenia macrophylla seedlings submitted to drought stress

Abstract

Tropical plants species face a very particular environment with highly variable light intensity, heat, low mineral availability and other abiotic stresses which might have led to the evolution of specific protective mechanisms. The understanding of mechanisms for tolerance over abiotic stress in these plants could help to protect tropical forests, allow a more intelligent grow of economically interesting species and improve crops.

The study of non-model plants, the category for most tropical species, is hindered by the amount of available information and the quality of this data. Swietenia macrophylla has not been sequenced, since the end of this work. To perform an evaluation of gene expression it was necessary to clone previously partial sequences for all required genes and to design specific primers for PCR amplification, including the reference genes. This work was supported by phylogenetic analysis, nourished by available sequences of related species. On the contrary, Jatropha curcas is on its way to becoming a novel model-species for genetic and eco-physiological studies. The species was sequenced in 2010 and had already some studies of gene expression under abiotic stress. Even when it is a helpful aspect to be able to compare results with other studies, it was demonstrated here that the provided information still needs to be carefully evaluated before it is used. The validity of the information for 2CP, APX, GPX and CAT obtained in two different databases, was corroborated by cloning full cDNA sequences. The characterization of genes belonging to the enzymatic antioxidant system in chloroplasts was performed by studies of exon and for 2CP and APX, the chloroplast targeting was confirmed by transient transformation of N. benthamiana with a construct carrying the signal peptide and a reporter gene.

Stress experiments were performed in outdoor conditions in Panama for Swietenia, and also in greenhouse conditions in Berlin, for Jatropha; they included mainly variations in temperature and irradiance. Physiological parameters such as stem elongation, leaf area, and biomass production seemed different between the two species, praising Jatropha for its capacity of growth regulation during mild and severe drought stress. Nevertheless, PSII quantum yield and CO2 assimilation rates in Swietenia unveiled an unexpected photosynthetic capacity during drought.

The gene regulation of the antioxidant enzymes in Swietenia proved, in most cases, to be similar to the description for other C3 drought sensitive plants such as Arabidopsis. Though few times reached statistical significance, there was considered that plants under treatment experienced a trend for up-regulation in 2CP, APX and GPX during mild stress, for down-regulation during severe stress, and after re-watering, all three genes came back to regular expression. In the case of Jatropha, there was not one single trend for each gene. During mild stress, 2CP was not regulated and APX was down-regulated. During severe stress and re-watering, there was reported a pattern of expression for each gene, depending on the growth conditions of each experimental setup. Moreover, CAT was inhibited by low light intensities in Jatropha at all phases of the experiment and was not upregulated during mild or severe stress inadequate light intensities.

Based on the final holistic evaluation, it can be confirmed that the regulation mechanism of the antioxidant system in the chloroplasts is more sensitive in Jatropha. Counting only the genes evaluated in both species, there was a fine-tuning regulation in the antioxidant system of Jatropha that was not observed in Swietenia. Jatropha curcas can be considered as more tolerant to drought because it can adjust gene transcription levels more specifically, presenting various regulation patterns for each gene and in all evaluated drought conditions, in a balanced way.

Tropische Pflanzenarten sind einer sehr spezifischen Umgebung mit stark schwankender Lichtintensität, Wärme, geringer Mineralverfügbarkeit und anderen abiotischen Stressfaktoren ausgesetzt, die zur Entwicklung spezifischer Schutzmechanismen geführt haben könnten. Das Verständnis von Mechanismen der abiotischen Stresstoleranz könnte helfen, tropische Wälder zu schützen, ein intelligenteres Wachstum von wirtschaftlich interessanten Arten zu ermöglichen und Nutzpflanzen zu verbessern.

Die Untersuchung von Nichtmodellpflanzen, der Kategorie für die meisten tropischen Arten, wird durch die geringe Anzahl an verfügbaren Informationen und die Qualität dieser Daten behindert. Swietenia macrophylla ist bis zum Ende dieser Arbeit nicht sequenziert. Um eine Evaluierung der Genexpression durchzuführen, war es notwendig, zuvor Teilsequenzen für alle erforderlichen Gene zu klonieren und spezifische Primer für die PCR-Amplifikation, einschließlich der Referenzgene, zu entwerfen. Diese Arbeit wurde durch eine phylogenetische Analyse gestützt, genährt von verfügbaren Sequenzen verwandter Arten. Im Gegenteil ist Jatropha curcas auf dem Weg eine neue Modellspezies für genetische und ökophysiologische Studien zu werden. Die Art wurde 2010 sequenziert und es gibt bereits einige Studien zur Genexpression unter abiotischem Stress. Auch wenn es ein hilfreicher Aspekt ist, Ergebnisse mit anderen Studien vergleichen zu können, wurde hier gezeigt, dass die bereitgestellten Informationen noch sorgfältig ausgewertet werden müssen, bevor sie verwendet werden. Die Gültigkeit der Information für 2CP, APX, GPX und Catalase in zwei Datenbanken wurde durch Klonen vollständiger Sequenzen bestätigt. Die Gencharakterisierung für das enzymatische Antioxidationssystem in Chloroplasten wurde durch Exonstudien durchgeführt, und für 2CP und APX wurde das Targeting der Chloroplasten durch transiente Transformation von N. benthamiana mit einem Konstrukt, das das Signalpeptid und ein Reportergen trägt, bestätigt.

Stressexperimente wurden unter Freilandbedingungen in Panama für Swietenia und auch in Gewächshausbedingungen in Berlin für Jatropha durchgeführt; Sie beinhalteten hauptsächlich Schwankungen in Temperatur und Bestrahlungsstärke. Physiologische Parameter wie Stammlänge, Blattfläche und Biomasseproduktion sind zwischen den beiden Arten unterschiedlich und zeigen, dass Jatropha die Fähigkeit besitzt das Wachstums während unter leichten und schweren Trockenstress zu regulieren. Dennoch zeigten die PSII-Quantenausbeute und die CO2-Assimilationsraten in Swietenia eine unerwartete photosynthetische Kapazität während der Dürre.

Die Genregulation der antioxidativen Enzyme in Swietenia erwies sich in den meisten Fällen als ähnlich zu der Beschreibung für andere C3 dürreempfindliche Pflanzen wie Arabidopsis. Obwohl kaum signifikant, wurde ein Trend für 2CP, APX und GPX für die Hochregulation bei leichtem Stress, für die Runterregulation während des schweren Stresses und nach dem erneuten Gießen erkannt. Im Falle von Jatropha gab es kein Trend in der Genexpression. Bei leichter Belastung war 2CP nicht reguliert und APX wurde herunterreguliert. Während starker Belastung und erneuter Bewässerung wurde ein Expressionsmuster für jedes Gen beobachtet, abhängig von den Wachstumsbedingungen jeder Versuchsanordnung. Darüber hinaus wurde CAT in allen Phasen des Experiments durch niedrige Lichtintensitäten in Jatropha gehemmt beobachtet und wurde während leichter oder starker Belastung nicht hochreguliert.

Basierend auf der abschließenden ganzheitlichen Bewertung kann bestätigt werden, dass der Regulationsmechanismus des antioxidativen Systems in den Chloroplasten in Jatropha empfindlicher ist. Betrachtet man nur die bei beiden Spezies untersuchten Gene, so gab es eine Feinregulierung im antioxidativen System von Jatropha, die in Swietenia nicht beobachtet wurde. Jatropha kann als toleranter gegenüber Trockenheit angesehen werden, da sie die Genexpression spezifischer anpassen kann, indem sie verschiedene Regulationsmuster in allen Genen und unter allen Dürrebedingungen in ausgewogener Weise präsentiert.

Las plantas tropicales se enfrentan a un entorno muy particular con altas variaciones en intensidad de luz y temperatura, poca disponibilidad de minerales y otros tipos de stress abiótico que podrían haber llevado a la evolución de mecanismos específicos de protección. La comprensión de los mecanismos de tolerancia en estas plantas podría ayudar a proteger los bosques tropicales, permitir un crecimiento más inteligente de especies económicamente interesantes y mejorar los cultivos.

El estudio de plantas no-modelo, la categoría en la que se incluyen la mayoría de las especies tropicales, se ve obstaculizada por la cantidad de información disponible y la calidad de estos datos. Swietenia macrophylla no ha sido secuenciada hasta la culminación de este trabajo. Para realizar una evaluación de la expresión génica fue necesario clonar previamente secuencias parciales para todos los genes requeridos y diseñar cebadores (primers) específicos para la amplificación por PCR, incluidos los genes de referencia. Este trabajo fue respaldado por análisis filogenéticos y nutridos con las secuencias disponibles de especies relacionadas. Por el contrario, Jatropha curcas está en camino de convertirse en una nueva especie modelo para estudios genéticos y eco-fisiológicos. La especie fue secuenciada en 2010 y ya cuenta con algunos estudios de regulación génica bajo estrés abiótico. Incluso cuando es beneficioso poder comparar los resultados con otros estudios, aquí se demostró que la información provista debe ser cuidadosamente evaluada antes de ser utilizada. La validez de la información para 2CP, APX, GPX y CAT obtenida de dos bases de datos diferentes se corroboró clonando secuencias completas de cDNA. La caracterización de los genes pertenecientes al sistema antioxidante enzimático en los cloroplastos se realizó mediante estudios de exones; además, se confirmó la localización en el cloroplasto de 2CP y APX por transformación transitoria de N. benthamiana con un plásmido que portaba el pre-péptido marcador de localización y un marcador fluorescente.

Los experimentos de sequía se realizaron en condiciones al aire libre en Panamá para Swietenia, y también en condiciones de invernadero en Berlín, para Jatropha; incluyendo principalmente variaciones de temperatura e irradiación. Parámetros fisiológicos como el alargamiento del tallo, el área foliar y la producción de biomasa son diferentes entre las dos especies, distinguiendo a Jatropha por su capacidad de regulación del crecimiento durante periodo de sequía leve y grave. Sin embargo, el rendimiento cuántico del PSII y las tasas de asimilación de CO2 en Swietenia revelaron una capacidad fotosintética inesperadamente alta durante la sequía también.

La regulación génica de las enzimas antioxidantes en Swietenia demostró, en la mayoría de los casos, ser similar a la descripción de otras plantas sensibles a la sequía C3, como Arabidopsis. Aunque pocas veces alcanzó niveles de significancia estadística, se consideró que las plantas bajo tratamiento experimentaron una tendencia de regulación al incremento para 2CP, APX y GPX durante periodos de estrés leves; de regulación en reducción en los tres genes bajo estrés severo, y después de volver a regar, estos tres genes regresaron a la expresión regular. En el caso de Jatropha, no hubo una sola tendencia para cada gen. Durante estrés leve, 2CP no fue regulado y APX fue regulado negativamente. Durante estrés severo y recuperación, se observaron varios patrones de expresión para cada gen, dependiendo de las condiciones de crecimiento de cada experimento. Además, se observó que CAT se inhibía por la baja intensidad de la luz en Jatropha en todas las fases del experimento y no se regulaba positivamente durante el estrés leve o severo en condiciones lumínicas adecuadas.

Basado en la evaluación holística final, se puede confirmar que el mecanismo de regulación del sistema antioxidante en los cloroplastos es más sensible en Jatropha. Considerando solo los genes evaluados en ambas especies, hubo una delicada regulación del sistema antioxidante de Jatropha que no se observó en Swietenia. Jatropha curcas se puede considerar como más tolerante a la sequía porque puede ajustar los niveles de transcripción de los genes más específicamente, presentando varios patrones de regulación en cada uno los genes y en todas las condiciones de sequía evaluadas, de una manera equilibrada.