An integrative approach to epilithic diatom diversity analysis in tropical streams from the Lerma-Chapala Basin, Central Mexico

Abstract

The study and application of diatoms as biological indicators in Mexico is infrequent, despite the multiple advantages offered by these organisms in the assessment and monitoring of freshwaters. In the few diatom studies of Mexican freshwaters, there seems to be low species diversity and an inherent cosmopolitanism of taxa, contrary to what would have been expected of a megadiverse country. This was mainly because of 1) force-fitting identifications based on monographs from temperate regions and 2) the lone use of light microscopy for identifications, which not always differentiates between closely related species. In order to better assess the diatom diversity of the country and to set an identification baseline for future studies using diatoms as biological indicators, this dissertation presents an integrative approach to epilithic diatom diversity analysis in tropical streams from the Lerma-Chapala Basin, Central Mexico. This study is based on a representative sampling of diatoms from small, mostly undisturbed, mountain streams from the north and east sections of the basin, as well as samples from the west of the basin, which include the heavily polluted Lerma River and some of its major tributaries. Samples were collected during the most contrasting periods of the year, the rainy and dry seasons. In the first part of this work, the diatom samples of the small mountain streams from the north and east sections of the basin were cultivated for morphological, ecological, molecular and phylogenetic analysis. The morphological evaluation resulted in the largest diatom diversity reported for Mexico to date, 274 infrageneric taxa, including the description of two new species, Brachysira altepetlensis and Sellaphora queretana. The ecological analysis revealed that the community composition observed was mainly driven by the ionic composition of the water, with indicator taxa identified for the varying conditions in pH, conductivity and nutrients. Under the premise that diatom identifications at species level in environmental DNA (eDNA) metabarcoding studies rely heavily on the completeness of reference databases, a regional morphological and molecular taxonomic reference library was assembled by diatom cultivation. The eDNA metabarcoding approach tested here, which integrates molecular and tree-based phylogenetic methods, revealed a larger diversity than the one recorded by morphological analysis. One quarter of the taxa assigned to species level in the eDNA metabarcoding approach was attributable to the herein assembled taxonomic reference library, supporting the aforementioned premise. The use of a regional sequence reference database is to increase the identification success, particularly in poorly studied regions such as the tropics. By comparing the diversity retrieved by morphology and eDNA metabarcoding, it was found that neither morphology nor eDNA metabarcoding were a better method than the other in catching the entire diversity; they were rather complementary. The cultivation of diatoms revealed a concealed diversity not detected by morphology or eDNA metabarcoding, suggesting cultivation as a further method to unravel species diversity from environmental samples. The relative abundances recorded by morphology (diatom valves) and eDNA metabarcoding (sequence reads) showed large disparities, even after the application of correction factors. This suggests that further methodological improvements are needed in order to establish eDNA metabarcoding as a standard method for water analysis. Furthermore, the results presented here support the retrieval of DNA reference barcodes from High-Throughput Sequencing data. In the second part of this study all the samples, including those from the Lerma River and its major tributaries, were studied by microscopy (light and scanning electron microscopy) in order to prepare a detailed illustrated identification guide. The analysis resulted in 307 infrageneric taxa, with the description of ten new species, belonging to Cocconeis, Craticula, Gomphonema and Sellaphora. This identification guide represents the baseline for diatom identification in future monitoring studies and programs in the region. In the third part of this dissertation, the taxonomy and systematics of the Planothidium lanceolatum/P. frequentissimum species complexes were explored by morphological and molecular data obtained from clonal cultures and from sequences deposited at the INSDC databases. Besides Mexico, the analyzed strains came from France, Germany, the Faroe Islands, Korea, Lake Baikal in Russia, New Zealand and the USA. The analysis resulted in the recognition of eight species, with three described as new to science. Both molecular and morphology-based phylogenetic analyses led to postulate the sinus and cavum as important stable taxonomic characters. The fine-grained taxonomy applied in this study allowed to revisit the distribution of Planothidium frequentissimum and P. lanceolatum, taxa previously considered to be cosmopolitan. Morphological and molecular based approaches for the study of diversity are often seen as antagonistic, with morphology seen as methodologically outdated and time consuming while molecular methods are seen as a means of choice. However, the results of this study rather underline complementarity of both methods. The integrative approach to the study of diatoms presented in this dissertation allowed an improved assessment of the diversity of epilithic diatoms from the Lerma-Chapala Basin, Central Mexico, setting the baseline for future monitoring studies in this biodiversity rich but threatened region of Mexico.

Untersuchungen zu Anwendungen von Diatomeen als Bioindikatoren sind trotz der vielfältigen Vorteile, die diese Organismen bei der Beobachtung und Begutachtung von Süßwasser bieten, in Mexiko selten. In den wenigen Studien zu Mexikos Süßwassersystemen wird von einer geringen Artenvielfalt und überwiegend kosmopolitischen Taxa ausgegangen. Dies rührt vor allem aus (1) der Identifikation der Taxa ausschließlich nach Monographien der gemäßigten Zonen und (2) der alleinigen Nutzung der Lichtmikroskopie zur Identifikation, die nicht immer eine Unterscheidung nah verwandter Arten erlaubt. Zur genaueren Untersuchung der Diatomeenvielfalt des Landes und zur Schaffung einer Grundlage für zukünftige Arbeiten, die Diatomeen als Bioindikatoren behandeln, wird mit dieser Dissertation ein integrativer Ansatz zur Analyse der Vielfalt epilithischer Diatomeen in tropischen Bächen des Lerma-Chapala Beckens in Zentralmexiko vorgelegt. In dieser Arbeit wurden repräsentative Proben von Diatomeen aus kleinen, weitgehend ungestörten Bergbächen aus den nördlichen und östlichen Teilen sowie dem westlichen Teil des Beckens verwendet. Diese Region schließt auch den stark verschmutzten Fluss Lerma und einige seiner wichtigsten Zuflüsse ein. Es wurden Proben während der beiden kontrastreichsten Saisons des Jahres gesammelt, der Trocken- und der Regenzeit. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Diatomeen aus den Proben der kleinen Bergbäche aus dem Nord- und Ostteil des Beckens für morphologische, ökologische, molekulare und phylogenetische Analysen kultiviert. Die morphologischen Untersuchungen ergaben die größte, bisher dokumentierte Vielfalt an beschriebenen Diatomeenarten Mexikos: 274 infragenerische Arten, darunter die Beschreibung zweier neuer Arten, Brachysira altepetlensis und Sellaphora queretana. Die ökologische Untersuchung zeigte, dass die beobachtete Zusammensetzung der Gemeinschaft vor allem durch die Ionenkonzentration des Wassers bestimmt wird. In Abhängigkeit der weiteren Parameter pH, Leitfähigkeit und Nährstoffgehalt konnten relevante Indikatorarten identifiziert und zugeordnet werden. In dem Wissen, dass die Identifikation von Diatomeen auf Artenebene mittels Environmental DNA (eDNA) Metabarcoding stark von der Vollständigkeit von Referenzdatenbanken abhängt, wurde eine regionale morphologische und molekulartaxonomische Referenzbibliothek mittels Diatomeenkultivierung erstellt. Der hier getestete eDNA-Metabarcoding-Ansatz, der molekulare und phylogenetische Stammbaum-Methoden zur Taxazuordnung einsetzt, offenbarte eine größere Vielfalt als die morphologischen Untersuchungen. Ein Viertel der Taxa, die durch die eDNA-Metabarcoding-Analyse auf Artenebene zugeordnet wurden, konnte nur auf Grundlage der eigens erstellten Referenzbibliothek zugeordnet werden. Der Nutzen einer regionalen Sequenzdatenbank als Referenz liegt in der Steigerung des Identifikationserfolges, speziell in weniger gut untersuchten Regionen wie den Tropen. Im Vergleich der gefundenen Artenvielfalten durch morphologische Untersuchungen einerseits und eDNA-Metabarcoding-Analysen andererseits, zeigte sich, dass keine der beiden Methoden der anderen überlegen ist; die Methoden sind vielmehr als komplementär zu betrachten. Die Kultivierung und Analyse zusätzlicher Diatomeen brachte noch weitere Arten zum Vorschein, die durch reine Evaluierung der Umweltproben nicht detektiert werden konnten. Dies unterstreicht die enorme Bedeutung der Diatomeenkultivierung als ergänzende Methode zur Erschließung der Artenvielfalt. Die relativen Häufigkeiten, die durch die morphologische Untersuchung (Diatomeenschalen) oder die eDNA-Metabarcoding-Analyse (Sequenzen) verzeichnet werden konnten, zeigten im Vergleich der beiden Ansätze große Unterschiede, sogar nach Anwendung von Korrekturfaktoren. Dies weist darauf hin, dass weitere methodische Verbesserungen notwendig sind um eDNA-Metabarcoding als Routineverfahren zur Wasseranalyse einzusetzen. Desweiteren zeigen die Ergebnisse, dass DNA-Barcodes für die Referenzbibliothek durch Hochdurchsatzsequenzierung (HTS) gewonnen werden können. Im zweiten Teil der Arbeit wurden alle Proben, auch diejenigen des Flusses Lerma und seinen größeren Zuflüssen durch Mikroskopie (Licht - und Rasterelektronenmikroskopie) untersucht, um detaillierte und bebilderte Bestimmungsreferenzen zu erhalten. Es konnten 307 infragenerische Taxa identifiziert werden, wobei zehn neue Arten beschrieben werden konnten, die zu den Gattungen Cocconeis, Craticula, Gomphonema und Sellaphora gehören. Diese Identifikationsdaten dienen als Grundlage für zukünftige Forschungsarbeiten in der Region. Im dritten Teil der Dissertation wurde die Taxonomie und Systematik des Artenkomplexes Planothidium lanceolatum / P. frequentissimum mittels morphologischer und molekularer Daten, die aus Klonkulturen und aus INSDC-Sequenzen gewonnen wurden, untersucht. Neben Mexiko stammen die untersuchten Kulturen aus Frankreich, Deutschland, den Färöer Inseln, Korea, dem russischen Baikalsee, Neuseeland und den USA. Es konnten acht Arten identifiziert werden, darunter drei für die Wissenschaft neue. Sowohl die molekularen als auch die morphologisch-phylogenetischen Untersuchungen führten zur Erkenntnis, dass Sinus und Cavum wichtige stabile, taxonomische Merkmale darstellen. Der detaillierte und integrative Ansatz der Taxonomie, der in dieser Arbeit angewendet wurde, erlaubte eine Neubewertung der Zuordnung der Taxa Planothidium frequentissimum und P. lanceolatum, die bis dato als kosmopolitisch eingestuft wurden. Morphologische und molekularbasierte Ansätze zur Untersuchung der Artenvielfalt werden oft als antagonistisch behandelt, wobei die morphologische Analyse als methodisch überholt und zeitaufwändig gilt und die molekulare Methode als Mittel der Wahl erachtet wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen jedoch gerade die Komplementarität beider Ansätze auf. Der integrative Ansatz zur Untersuchung von Diatomeen, der in dieser Dissertation vorgelegt wird, führt zu einer besseren Beschreibung der Artenvielfalt epilithischer Diatomeen des Lerma-Chapala Beckens in Zentralmexiko. Es wurde somit die Grundlage für zukünftige Forschungsarbeiten in dieser artenreichen, aber gefährdeten Region Mexikos geschaffen.