Influence of cycle stage, age and biopsy score on oxytocin receptor gene expression and distribution in the cervix and uterus of non-pregnant mares

Abstract

Each year numerous mares fail to fall pregnant despite optimised breeding management (no obvious reason of infertility in mare, good semen quality of stallion, correct timing of breeding, good insemination technique and postbreeding management; Da Silva 2008). These mares are considered subfertile (Da Silva 2008). Various reproductive pathologies may cause a mare to not conceive or to lose a pregnancy at an early stage, with uterine pathologies including post-breeding endometritis being one of the most important reasons (Carnevale 2008). Uterine clearance is one of the most important components of the uterine defence mechanism against infection (Troedsson 1999). Mares incapable of efficient uterine clearance and consequently incapable of resolving the transient physiological endometritis are likely to develop a persistent post-breeding endometritis leading to prolonged inflammation of the endometrium and consequently embryonic loss and subfertility (Troedsson 1999; Troedsson et al. 2001; Watson 2000). Oxytocin, a neuropeptide hormone produced by the hypothalamus and endometrium of the mare (Behrendt–Adam et al. 1999, Handler 2001, Gimpl and Fahrenholz 2001, Bae and Watson 2003) is the main hormone responsible for contractions of smooth muscles in the oviduct, uterus and the myoepithelial cells of the mammary gland and is thus of importance for uterine clearance (Handler 2001). Oxytocin is additionally considered to be important in luteolysis (Betteridge et al. 1985; Goff et al. 1987; Goff et al. 1993). Oxytocin acts on target tissues by binding to its receptors. Oxytocin receptors (ORs) have been described in various tissues including tissues outside the genital tract (Gimpl and Fahrenholz 2001). The important role of oxytocin in the equine oestrous cycle as well as in uterine clearance supports the need to investigate the location of ORs in the mare’s reproductive tract (endometrium, myometrium and cervix). Previous studies have shown changes in the concentration of ORs in the equine endometrium throughout the oestrous cycle, with a reported peak during late dioestrus. There are, however, no reports comparing OR density and distribution in the myometrium and cervix of the non-pregnant mare during the different oestrous cycle stages. Despite considerable support for oxytocin playing an important role in the uterine defence mechanism and hence fertility, its exact significance is poorly defined. This study described the distribution and density of ORs in the mare’s endometrium, myometrium and cervix during the luteal and non-luteal phases and additionally within different mare categories based on age and endometrial biopsy score using both immunohistochemistry (IHC) and quantitative reversetranscription polymerase chain reaction (RT-qPCR). Full-thickness uterine samples and endometrial biopsy samples were obtained from 27 routinely-slaughtered, cyclic mares of various breeds and ages (10 mares > 10 years old, 17 mares < 10 years old) at three different uterine sites (uterine body, right and left horn) and one sample from the cervix. Endometrial biopsy sample sections were stained with haematoxylin and eosin by standard techniques and sections were graded I, IIa, IIb, or III according to the Kenney and Doig categorisation scheme. For IHC, all endometrial, myometrial and cervical samples were immunolabeled using an avidin-biotinperoxidase complex (ABC) detection system and a polyclonal antibody against human ORs. Sections were evaluated using an Olympus light microscope and the Olympus cell sens dimension software. Additional samples obtained from the left uterine horn (endometrium and myometrium) and the cervix (luminal epithelium, propria-submucosa and muscularis layer) were used for the RT-PCR assay. Oligonucleotide primers and probe sequences used for detection of OR and β-actin gene expression were obtained from three previous studies evaluating OR gene expression and distribution in the equine conceptus, fetal membranes, endometrium of pony mares at parturition and in endometrium, myometrium and cervix of non-pregnant mares. A RT-qPCR was used for detection of the OR messenger-ribonucleic acid (mRNA). The ΔΔCt method using the StepOnePlus™ software was employed as a descriptive method to quantify different gene expression between tissues and ΔCt values were used for statistical analyse of the data. Five (18.52 %; one old mare and four young) mares showed a grade I biopsy score, sixteen (59.26 %, six old and 10 young) mares showed a grade IIA biopsy score and six (22.22 %) mares showed a grade IIB biopsy score. None of the mares in the study population showed a grade III biopsy score. All mares with biopsy score I were in the luteal phase and all mares with biopsy score IIB were in the non-luteal phase of their cycles. There was no significant difference in biopsy scores between old and young mares (P = 0.386). Mares in the non-luteal phase had significantly lower biopsy scores (I = highest score, IIB = lowest score) compared to mares in the luteal phase (P = 0.003). By means of immunolabeling, ORs could be identified as fine brown granules in the cytoplasm of selected cells in both negative- and positive-tissue control tissues and in the test sections. No difference in OR distribution nor intensity of staining could be detected between mares in luteal and nonluteal phases, between old and young mares and between mares with different biopsy scores. Looking at fold differences, relative to expression of OR gene RT-qPCR analysis showed higher expression of the OR gene during the non-luteal phase in myometrium (26 times), endometrium (2 times) and cervix (3 times). Statistically the myometrium was found to have significantly higher OR gene expression during non-luteal than during luteal phases (P = 0.004). There was no significant difference in the gene expression of ORs when comparing luteal and non lutealphases in endometrium (P = 0.574) and the cervix (P = 0.339). Statistical analysis of the RT-qPCR data did not demonstrate a significant difference between OR gene expression in young and old mares or between mares with different endometrial biopsy scores (P = 0.601).

Jedes Jahr werden zahlreiche Stuten trotz optimalem Zuchtmanagement (kein offensichtlicher Grund für Unfruchtbarkeit bei der Stute, gute Samenqualität des Hengstes, korrektes Timing der Besamung, gute Besamungstechnik und Management nach der Besamung) nicht trächtig (Da Silva 2008). Diese Stuten werden als subfertil bezeichnet (Da Silva 2008). Verschiedene Fortpflanzungspathologien können dazu fuehren, dass eine Stute nicht trächtig wird oder in einem frühen Stadium Fruchtresorption erleidet. Pathologische Veraenderungen der Gebärmutter, wie Endometritis nach der Deckung, werden als einer der Hauptgründe dafür gesehen (Carnevale 2008). Die uterine Säuberung ist einer der wichtigsten Bestandteile des Abwehrsystems gegen Infektionen (Troedsson 1999). Stuten, die unfähig zur effizienten uterinen Selbstreinigung sind und folglich unfähig sind, die vorübergehende physiologische Endometritis zu beheben, unterliegen einer großen Wahrscheinlichkeit eine chronische Endometritis nach der Deckung zu entwickeln. Diese führt zur längeren Entzündung der Gebärmutterschleimhaut und somit zum Verlust des Embryos und zur Unfruchtbarkeit (Troedsson 1999; Troedsson et al 2001;. Watson 2000). Oxytocin, ein Neuropeptidhormon, das vom Hypothalamus und Endometrium der Stute produziert wird (Behrendt-Adam et al. 1999; Handler 2001; Gimpl und Fahrenholz 2001; Bae und Watson 2003), ist hauptverantwortlich für die Kontraktionen der glatten Muskulatur im Eileiter, der Gebärmutter und der Myoepithelzellen der Brustdrüse im Pferdereproduktionstrakt und damit wichtig fuer die uterine Säuberung (Handler 2001). Oxytocin wird zusätzlich bei der Luteolyse als wichtig erachtet (Betteridge et al 1985; Goff et al 1987; Goff et al., 1993). Oxytocin wirkt auf das Zielgewebe ein, indem es an seine Rezeptoren bindet. Oxytocin Rezeptoren (OR) wurden in verschiedenen Geweben auch außerhalb des Genitaltraktes (Gimpl und Fahrenholz 2001) beschrieben. Die bedeutende Rolle von Oxytocin im Sexualzyklus der Stute sowie bei der uterinen Säuberung erklärt die Notwendigkeit, die Lokalisation von ORs im Reproduktionstrakt (Endometrium, Myometrium und Zervix) von Stuten zu untersuchen. Früheren Studien war es möglich Veränderungen in der Konzentration von ORs in Endometrium des Pferdes während des Sexualzyklus mit einem Höhepunkt im späten Diöstrus aufzuzeigen. Es gibt jedoch keine Analysen, welche die OR Dichte und Verteilung im Myometrium und Gebärmutterhals der nicht trächtigen Stute zwischen verschiedenen Zyklusstadien vergleichen. Trotz des begründeten Verdachts, dass Oxytocin eine wichtige Rolle im Gebärmutterabwehrmechanismus und damit für die Fruchtbarkeit der Stute spielt, gibt es keine Studie, die genauere Auswirkungen untersucht. Die vorliegende Studie untersucht mit Hilfe von Immunohistochemie (IHC) und quantitativer reversetranscription polymerase chain reaction (RT-qPCR) die OR Verteilung und Dichte im Endometrium, Myometrium und in der Zervix der Stute während der Gelbkörper und Nicht-Gelbkörperphase, sowie in verschiedenen Fruchtbarkeitsgruppen (basierend auf der Alter und Endometriumbiopsiekategorie). Als Forschungsproben wurden transmurale Uterusbiopsien sowie eine Endometriumbiopsie von 27 routinemäßig geschlachteten, zyklischen Stuten verschiedener Rassen und Altersgruppen (10 Stuten> 10 Jahre alt, 17 Stuten <10 Jahre alt) von 3 verschiedenen Stellen im Uterus (Corpus uteri, rechtes und linkes cornus uteri) und von der Zervix entnommen. Schnitte der Endometriumbioptate wurden mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardtechniken gefärbt und anschließend entsprechend dem Kenney und Doig Kategorisierungsschema den Kategorien I, IIa, IIb oder III zugeordnet. Für die IHC wurden alle Endometrium-, Myometrium- und Zervixproben mit einem Immunperoxidase-Detektionssystem und einem polyklonalen Antikörper gegen humane ORs immunmarkiert. Die Schnitte wurden unter Verwendung eines Olympus Lichtmikroskop und der Olympus cell sens Dimension Software ausgewertet. Weitere Proben vom linken Uterushorn (Endometrium und Myometrium) und der Zervix wurden für einen RT-qPCR-Assay verwendet. Zum Nachweis von ORs und β-Actin Genexpression wurden Oligonukleotid-Primer und Sonden-Sequenzen verwendet, mit welchen bereits in drei früheren Studien ORs im Pferdekonzeptus, fötalen Membranen,im Endometrium von Ponystuten bei der Geburt und in Endometrium, Myometrium und Zervix von nichtträchtigen Stuten nachgewiesen werden konnten. Mit Hilfe der RT-qPCR wurde die messenger-ribonucleic acid (mRNA) ermittelt und das ΔΔCt Verfahren unter Verwendung der StepOnePlus™ Software zur Analyse der Daten herbeigezogen. Fünf (18,52%, 1 alte Stute und 4 junge Stuten) Stuten konnten der Kategorie I, sechzehn (59,26%, 6 Stuten und 10 junge Stuten) der Kategorie IIA und sechs (22,22%) der Kategorie IIB des Endometriumbiopsiekategorieschemas zugeordnet werden. Keine der Stuten in der Studienpopulation wurde in die Kategorie III eingeteilt. Alle Stuten der Kategorie I befanden sich in der Gelbkörperphase und alle Stuten der Kategorie IIB in der Nicht-Gelbkörperphase ihrer Zyklen. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Biopsiekategorien zwischen alten und jungen Stuten festgestellt werden (P = 0,386). Pferde in der Nicht-Gelbkörperphase hatten jedoch eine signifikant schlechtere Einordnung in Biopsiekategorien (I = beste Kategorie, III = schlechteste Kategorie) im Vergleich zu Pferden in der Gelbkörperphase (P = 0,003). Oxytocin Rezeptoren konnten mittels Immunmarkierung als feine braune Granula im Zytoplasma von ausgewählten Zellen sowohl im Negativ- als auch im Positiv-Kontrollgewebe und in den Testabschnitten identifiziert werden. Zwischen Stuten in Gelbkörper- und Nicht-Gelbkörperphase, alten und jungen Stuten und zwischen Stuten mit verschiedenen Biopsiekategorien konnte weder ein Unterschied in der OR Verteilung, noch in der Intensität der Färbung nachgewiesen werden. Die RT-qPCR Analyse zeigt höhere OR-Genexpressionen während der Nicht-Gelbkörperphase im Myometrium (26 mal), Endometrium (2 mal) und der Zervix (3 mal) in Bezug auf die Expression von OR-Genen während der Gelbkörperphase. Statistisch gesehen besaß das Myometrium signifikant mehr ORs während der Gelbkörperphase als während der Nicht-Gelbkörperphase (P = 0,004). Es gab keinen signifikanten Unterschied für die OR-Konzentrationen im Endometrium (P = 0,0574), und in der Zervix (P = 0,339) in unterschiedlichen Zyklusphasen. Die statistische RT-qPCR Analyse wies weder einen signifikanten Unterschied zwischen der OR-Genexpression in jungen und alten Pferden nach, noch zwischen Pferden mit unterschiedlichen Biopsiekategorien.