Identifizierung und Charakterisierung von differentiell exprimierten Genen im Knochenmarkstroma bei der akuten myeloischen Leukämie

Abstract

Die akute myeloische Leukämie (AML) besitzt insbesondere bei älteren Patienten sowie Hochrisikopatienten oft noch eine sehr schlechte Prognose, so dass hier dringend neue Therapieansätze erforderlich sind. Das Tumor-Stroma („Microenvironment“), welches zu Progression, Therapieresistenz und eventuell auch Initiation der Erkrankung beizutragen scheint, stellt eine vielversprechende Zielstruktur für neue Therapien dar. Allerdings sind die zugrundeliegenden Mechanismen noch unzureichend verstanden. Daher wurde hier die Genexpression in mesenchymalen Stromazellen des Knochenmarks (BMMSC) - dem Microenvironment der hämatopoetischen und vermutlich auch leukämischen Stammzelle - von AML-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden untersucht. Es sollten Gene identifiziert werden, deren veränderte Expression zur Leukämie beitragen könnte und die somit potentielle Zielstrukturen für neue Therapien darstellen. Dazu wurden mittels Microarray generierte Genexpressionsdaten der BM-MSC von 19 Patienten mit AML Erstdiagnose (ED) und 4 gesunden Probanden mit Hilfe bioinformatischer Analysen (DAVID Bioinformatics) analysiert und so Kandidatengene identifiziert, deren Expression nachfolgend mittels qRT-PCR an einer unabhängigen Kohorte gesunder Normalpersonen (NP) und AML-Patienten ED bestimmt wurde. Anschließend wurden für einen der Kandidaten, den Wachstumsfaktor Insulin-like growth factor 2 (IGF2), funktionelle Analysen angeschlossen. Die bioinformatische Analyse der in den AML-BM-MSC differentiell exprimierten Gene aus den Microarray-Analysen zeigte, dass diese Gene in Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Immunantwort involviert sind. Eine Überexpression konnte anschließend für IGF2 mittels qRTPCR bestätigt (AML ED n = 63, NP n = 9, p = 0,003) und auch in der Remission noch nachgewiesen werden (AML n = 44, NP n = 9, p = 0,028). Bei den nachfolgenden funktionellen Analysen für IGF2 wurde zunächst an einer Kohorte von 130 AML ED gezeigt, dass die Blasten Rezeptoren für IGF2 exprimieren; eine Grundvoraussetzung, damit IGF2 einen direkten Einfluss auf diese ausüben kann. Anschließend wurde mit einem Proliferations-Assay (WST1) der mitogene Einfluss von IGF2 auf Leukämiezelllinien und primäre Blasten untersucht. Hier konnte kein signifikanter Effekt festgestellt werden. Die abschließend durchgeführte Korrelation der IGF2-Expression in den AML-BM-MSC mit der Ausprägung klinischer Merkmale zeigte keine statistisch signifikanten Korrelationen; jedoch konnte bei erhöhter IGF2-Expression eine Tendenz zu einer kürzeren Überlebenszeit beobachtet werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass in den AML-BM-MSC eine gegenüber Gesunden veränderte Genexpression vorliegt und dass die Überexpression des Wachstumsfaktors IGF2 einen Mechanismus darstellen könnte, über den das Stroma die Leukämie fördert. Weitere Analysen bezüglich der funktionellen Bedeutung von IGF2 in der AML wären nötig sowie Untersuchungen, ob IGF2 möglicherweise eine Zielstruktur für neue Therapieansätze in der AML darstellen könnte.

The prognosis of acute myeloid leukemia (AML) is still very poor, especially for elderly patients and high risk patients. Hence, new therapies are still required. The tumor microenvironment is a promising target for new therapies. There is growing evidence that the microenvironment is relevant for cancer progression, therapy resistance and perhaps also cancer initiation. However, the underlying mechanisms are not yet fully understood. Here the gene expression in mesenchymal stromal cells from the bone marrow (BM-MSC) – the microenvironment of the hematopoetic and probably also the leukemic stem cell – of healthy donors (HD) and patients with AML at first diagnosis (FD) was compared. The aim was to identify genes whose altered expression could constribute to leukemia and could therefore become targets for new therapies. For this approach, the microarray data of AML-BM-MSC (n = 19) and HD-BM-MSC (n = 4) were analysed using bioinformatic tools (DAVID Bioinformatics) to identify genes of interest. For these candidates the expression was determined with qRT-PCR in an independent cohort of patients (AML FD) and healthy donors. Subsequently functional analyses for one candidate, the Insulinlike growth factor 2 (IGF2), were performed. The bioinformatic analyses showed that the differently expressed genes in AML-BM-MSC are involved in processes such as proliferation, differentiation and the immune system. Using qRTPCR, an overexpression of IGF2 could be validated (AML FD n = 63, HD n = 9, p = 0,003). In addition, IGF2 overexpression was also shown for AML-BM-MSC in remission (AML n = 44, HD n = 9, p = 0,028). In the functional analyses for IGF2 first it was demonstrated in a cohort of 130 AML FD that the blasts express receptors for IGF2, a prerequisite for direct IGF2 influence on leukemic blasts. To study the mitogenic effect of IGF2 on leucemic cells, IGF2 was subsequently added to leukemic cell lines and primary AML blasts. However, an impact on proliferation could not be observed. Finally, a correlation between IGF2 expression in AML-BM-MSC and clinical parameters was investigated, but lacked statistical significant results. Though a non-significant trend of elevated IGF2 expression and shortened overall survival was observed. In summary, AML-BM-MSC exhibit an altered gene expression and IGF2 overexpression might be a mechanism of the stroma to constribute to leukemia. Further analyses are required to explore the role of IGF2 in AML in more detail and to test whether IGF2 could become a new target in AML therapy.