Optimisation of a transcription-translation coupled in vitro system

Abstract

Cell-free protein synthesis exploits the catalytic machinery of the cell to produce active proteins. An in vitro system is flexible and well controlled, and it offers several advantages over conventional in vivo technologies such as easy ways for purification, synthesis of regulatory and/or toxic proteins, incorporation of artificial or modified amino acids that might be doted with isotopes required for NMR. Here I describe experiments exploring optimisation possibilities concerning yield and quality of the synthesised protein. Some experimental strategies also include expression of eukaryotic genes in prokaryotic expression systems. The following results have been achieved: 1: Quality criteria developed that allow a critical evaluation of parameters important for the coupled transcription/translation system or improving the yield and quality of the synthesized protein exploiting the features of the green fluorescent protein GFP. 2: The standard transcriptase used in overexpression studies in vivo and in vitro is the T7 polymerase. The fundamental difficulty with this enzyme is the fact that it is about six times faster than the E. coli transcriptase and thus uncouples transcription from translation, a possible reason for the fact that in vitro systems usually produce proteins with an activity of 30 to 60% only. We tested some slow mutants of T7 polymerase that approached the rate of the E. coli transcriptase and observed indeed a significant improvement up to 100% of the active fraction, although at the cost of lower yields. 3: A similar improvement of the active fraction was observed at lower incubation temperatures down to 20°C, again at the cost of lower yields. 4: According to literature data some amino acids are metabolised during in vitro incubations and thus could cause a limitation of protein synthesis. Indeed, we demonstrate that a second addition of amino acids in the middle of the incubation triggers a burst of further protein synthesis. Using this trick at 20°C pushed the yield of protein to almost that seen at 30°C, but now with an active fraction of 100%. In contrast, our analysis revealed that NTPs are not limiting the gene expression in vitro in our system (modified Roche RTS). 5: It is known that the codon usage of highly and lowly expressed proteins in E. coli differs dramatically. When we examined this point with human genes, to our surprise a corresponding difference could not be observed. Due to this fact it was possible to identify 11 tRNAs the corresponding codon are quite often used in human genes but rarely in E. coli genes. Therefore, for a good expression of eukaryotic genes in E. coli systems these 11 tRNAs should be added (and not only the 7 tRNAs supplied in systems from Novagen). 6: I outlined some ways to improve further the expression system.

Zellfreie Proteinsynthese benutzt den Translations- und manchmal auch den Transkriptionsapparat der Zelle zur Synthese aktiver Proteine. Ein in vitro System ist flexibel und gut kontrollierbar, und es birgt zahlreiche Vorteile gegenüber in vivo Techniken, Beispiele sind Synthese von regulativen und/oder toxischen Proteinen, Einbau von artifiziellen oder modifizierten Aminosäuren, die sogar mit seltenen Isotopen für NMR Untersuchungen dotiert sein können. In dieser Arbeit beschreibe ich Experimente, die Optimierungs-möglichkeiten bezüglich Ertrag und Qualität der synthetisierten Proteine untersuchen. Einige Experimentalstrategien beziehen sich auch auf die Expression eukaryontischer Gene in prokaryontischen Systemen. Folgende Ergebnisse wurden erreicht: 1: Qualitätskriterien wurden entwickelt, die eine präzise Bestimmung der synthetisierten Proteinmenge als auch die aktive Fraktion zu messen gestatten. Dabei wurden die Eigenschaften des grün-fluoreszierenden Proteins GFP ausgenutzt. 2: Als Standard-Transkriptase wird in vivo als auch in vitro T7 Polymerase benutzt. Die grundsätzliche Schwierigkeit mit dieser Transkriptase beruht darauf, dass sie etwa sechs-mal schneller ist als die E. coli Transkriptase und damit Transkription von der Translation entkoppelt. Das ist vermutlich der Grund, weshalb in vitro Systeme Proteine produzieren, die nur zu 30 bis 60% aktiv sind. Wir testeten einige langsame T7 Polymerasen-Mutanten und beobachteten tatsächlich eine Verbesserung bis zu 100% der aktiven Fraktion, allerdings auf Kosten des Ertrags. 3: Eine ähnliche Verbesserung der aktiven Fraktion wurde bei verminderter Inkubationstemperatur (bis 20°C) beobachtet, jedoch wieder auf Kosten der synthetisierten Menge. 4: Von Literaturdaten wissen wir, dass einige Aminosäuren während der Inkubation metabolisiert werden, was die Proteinsynthese limitieren könnte. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass eine zweite Zugabe von Aminosäuren in der Mitte der Inkubation einen dramatischen Schub der Proteinsynthese auslöste. Die Kombination dieses Tricks mit einer Inkubation bei 20°C vermehrte die Proteinmenge zu der, die bei 30°C gefunden wurde, jetzt aber mit 100% aktiver Fraktion. 5: Es ist bekannt, dass der Codon-Gebrauch bei hoch und niedrig exprimierten Proteinen in E. coli deutlich unterschiedlich ist. Eine entsprechende Untersuchung von hoch und niedrig exprimierten Genen im menschlichen Genom offenbarte zu unserer Überraschung keinen unterschiedlichen Codongebrauch. Deshalb war es möglich, 11 tRNA anzugeben, deren zugehörige Codone recht häufig in eukaryontischen mRNAs anzutreffen sind, aber selten in E. coli mRNAs vorkommen. Diese 11 tRNAs sollten zur E. coli Gesamt-tRNA zugegeben werden, um eine optimale Expression eukaryontischer mRNA in E. coli Systemen zu gewährleisten. Unser Ergebnis kontrastiert zu den 7 tRNAs in Zahl und Art, die von Novagen angegeben werden. 6: Ich gebe schließlich zusätzliche Hinweise zu einer weiteren Optimierung der in vitro Proteinsynthese.