Einfluss von Hypothermie auf die Inflammationsreaktion nach kardiopulmonalem Bypass im Säuglingsalter: von einer klinischen Studie zurück in die Zellkultur

Abstract

Hintergrund: Der kardiopulmonale Bypass (CPB) induziert besonders bei Neugeborenen und Säuglingen eine prolongierte, systemische Inflammationsreaktion während herzchirurgischer Interventionen. Hypothermie ist das älteste Verfahren zur Organprotektion und dafür bekannt, die durch den CPB entstehende Inflammation zu reduzieren. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde ein in vitro Kokulturmodell aus Endothelzellen und Makrophagen in Anlehnung an den CPB entwickelt. In einem nächsten Schritt wurden die Effekte der Hypothermie auf die Inflammationsreaktion dieser Zelltypen mit den Ergebnissen einer pädiatrischen, prospektiv randomisierten Studie verglichen. Ziel war es, ein kliniknahes Zellkulturmodell zu entwickeln, um zukünftig weitere durch den CPB getriggerte Inflammationsmechanismen zu untersuchen. In einem weiteren Zellkulturmodell aus Kardiomyozyten wurde der Einfluss der Hypothermie auf die Inflammationsreaktion und die Kardioprotektion untersucht. Methoden: Das Kokulturmodell besteht aus humanen umbilikal-venösen Endothelzellen (HUVEC) und Monozyten (THP-1 Zelllinie). Die Zellen wurden mit Tumor Nekrose Faktor (TNF)- α stimuliert, um die Inflammation durch den CPB zu simulieren. Die Kokultur wurde tiefer Hypothermie (20°C) oder Normothermie (37°C) ausgesetzt. Zur Darstellung der Morphologie und Zelldifferenzierung wurde eine immunhistochemische Färbung durchgeführt. Die Vitalität der Zellen wurde mittels des 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay gemessen. In der prospektiv randomisierten Studie wurden 20 Patienten, die einen chirurgischen Verschluss eines Ventrikelseptumdefekts benötigten, unter normothermen (37°C) oder hypothermen (32°C) Bedingungen operiert. Im Zellkulturmodell und in der klinischen Studie wurden zu zwei vergleichbaren Zeitpunkten die proinflammatorischen Interleukine (IL) IL-6 und IL-8 mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder Multiplex Sandwich Immunoassay gemessen. Für Experimente an Kardiomyozyten wurde die kardiomyozytäre Zelllinie H9c2 verwendete. Die Proteinsekretion der phosphorylierten extrazellulär-regulierten Kinase (pERK) 1/2, der Cyclooxygenase-2 (COX-2) und des antiapoptotischen Proteins Akt wurde mittels Western Blot Technik analysiert. Ergebnisse: In dem Kokulturmodell aus Endothelzellen und Makrophagen zeigte sich ein signifikanter IL-6 und IL-8 Anstieg 2 und 24 Stunden nach Versuchsbeginn. In der klinischen Studie waren die Interleukine ebenfalls direkt nach Abgang vom CPB sowie nach 24 Stunden erhöht. Zwischen der normothermen und der hypothermen Gruppe konnte weder in der Zellkulturstudie noch bei den Patienten ein Unterschied in der Interleukinausschüttung nach 24 Stunden gezeigt werden. Somit ist die Inflammationsreaktion im Kokulturmodell vergleichbar mit dem Interleukinanstieg im Blut der Kinder, die unter Verwendung der Herz-Lungen- Maschine operiert wurden. Interessanterweise zeigten die Kardiomyozyten eine signifikante Reduktion der Inflammation durch pERK 1/2 und COX-2 unter hypothermen Bedingungen.

Cardiopulmonary bypass (CPB) is known to induce an inflammatory response that is influenced by various factors. Hypothermia is supposed to reduce inflammation after CPB. We developed an in vitro co-culture model for CPB and compared the effects of hypothermia on the inflammatory response in the co- culture model with results from a clinical prospective randomized trial. The co-culture model consisted of endothelial cells and monocytes. Cells were stimulated with TNF-α and exposed to deep hypothermia (20°C) or normothermia (37°C). In the clinical trial, 20 patients undergoing CPB for ventricular septum defect receive either normothermic (37°C) or mild hypothermic (32°C) CPB. We observed a significant IL-6 and IL-8 release in the co-culture model 2 and 24 hours after the experimental start. In the clinical trial, cytokines were significantly increased directly after weaning from CPB and remained elevated until 24 hours. IL-8 and IL-6 secretions were similar in the hypothermic and normothermic group of the co-culture model and the patients after 24 hours. These results demonstrate that the inflammatory reaction observed in our co-culture model is comparable with the cytokine increase in the blood of children undergoing CPB. Our co-culture model could be useful for studies on the mechanisms of CPB induced inflammation. The effect of hypothermia on inflammation and cardioprotection was investigated in a cardiomyocyte cell culture model using the H9c2 cell line. The phosphorylated extracellular regulated kinase 1/2 (pERK) protein secretion, the Cyclooxygenase-2 (COX-2), and the anti-apoptotic protein Akt were investigated using Western Blot. pERK 1/2 and COX-2 protein secretion was significantly downregulated in cardiomyocytes under hypothermic conditions.