Functional characterization of human peritoneal fibroblasts: implications for peritoneal immunity in patients treated with peritoneal dialysis

Abstract

Peritoneal dialysis (PD) is a life-saving renal replacement therapy for patients suffering for kidney failure. Long-term exposure of the peritoneal membrane to bioincompatible peritoneal dialysis fluids (PDFs) and repeated peritonitis episodes may provoke structural alterations that eventually lead to the development of fibrosis and technique failure. Peritoneal fibroblasts are key cellular players involved in these processes. The aim of the present study was to purify, identify and functionally analyze human peritoneal fibroblasts (HPFB) with regard to features relevant to successful PD. Having identified HPFB in cell culture and in peritoneal biopsies on the basis of fibroblast specific protein 1 (FSP-1) expression, I analyzed the capacity of HPFB for producing the chemokine CCL5 and found that HPFB synthesize large quantities of CCL5 upon stimulation with macrophage-derived IL-1β and TNF-α in a process that can be amplified by IFN-γ. Moreover, HPFB exposed to high glucose concentrations (corresponding to those in PDFs) showed increased expression of the transcription factor NFAT5 and the chemokine CCL2; the upregulation of these mediators appeared to be independent of each other. An intriguing feature of fibroblasts is their heterogeneity between different anatomic locations and within the same tissue. I found that HPFB in the peritoneum differed in the expression of Thy-1. Following isolation by magnetic activated cell sorting, Thy-1+ HPFB showed increased expression of α-SMA, collagen 1, and TGF-β in comparison to HPFB not expressing Thy-1. Furthermore, Thy-1+ HPFB displayed greater proliferation and contraction ability, suggesting that they could be more prone to acquire myofibroblastic phenotype and thus contribute to peritoneal fibrosis. Peritoneal biopsies from uremic, non-dialyzed, and PD-treated patients showed that both in the omentum and the parietal peritoneum Thy-1+ HPFB constituted the majority of fibroblasts as identified by the presence of FSP-1. In contrast, in healthy individuals FSP-1+ fibroblasts could not be detected in the parietal peritoneum whilst those present in the omentum contained similar proportions of Thy-1+ and Thy-1- cells. These observations indicate that the number of Thy-1 expressing fibroblasts may increase as a result of both uremia and PD therapy. Taken together, the results presented in this thesis demonstrate the involvement of HPFB in inflammatory responses occurring in the dialyzed peritoneum and show the existence of a subset of HPFB that may expand during PD and contribute to the development of peritoneal fibrosis.

Die Peritonealdialyse (PD) ist eine lebensrettende Nierenersatztherapie für Patienten mit Nierenversagen. Die langfristige Exposition der Peritonealmembran gegenüber bioinkompatiblen Peritonealdialyselösungen (PDF), aber auch wiederholte Peritonitisepisoden können strukturelle Veränderungen in Gang setzen, die letztendlich in einer peritonealen Fibrose und damit im Therapieversagen münden können. Wichtige zelluläre Elemente bei diesen Prozessen sind die peritonealen Fibroblasten. Das Ziel der vorliegenden Arbeiten war die Isolation, Identifikation und funktionelle Analyse von humanen peritonealen Fibroblasten (HPFB) speziell im Hinblick auf Eigenschaften, die für die erfolgreiche PD von Bedeutung sind. Im Anschluß an die Identifikation von Fibroblasten in Zellkultur oder Peritonealbiopsien anhand ihrer Expression von Fibroblast-Specific Protein 1 (FSP-1) untersuchte ich die Produktion des Chemokins CCL5 in HPFB und fand, daß sie große Mengen an CCL5 nach Stimulation mit IL-1β und TNF-α und amplifiziert durch IFN-γ synthetisieren. Nach Exposition gegenüber hohen Glukosekonzentrationen (wie sie für PDF typisch sind) zeigten HPFB eine vermehrte, jedoch voneinander unabhängige, Expression des Transkriptionsfaktors NFAT5 und des Chemokins CCL2. Eine besondere Eigenschaft von Fibroblasten ist ihre Heterogeneität zwischen verschiedenen anatomischen Lokalisationen innerhalb desselben Gewebes. Diesbezüglich konnte ich zeigen, daß die HPFBs im Peritoneum Unterschiede bezüglich ihrer Expression von Thy-1 aufweisen. Im Anschluß an ihre Isolation mittels magnetischer Zellsortierung zeigten Thy-1+ HPFB eine vermehrte Expression von α-SMA, Kollagen 1 und TGF-β im Vergleich mit Thy-1- HPFB. Weiterhin wiesen Thy-1+ HPFB eine vermehrte Proliferationskapazität und Kontraktionsfähigkeit auf. Dies legt nahe, daß Thy-1+ HPFB mehr zur Bildung eines myofibroblastoiden Phänotyps neigen und somit eher zur Entwicklung einer Peritonealfibrose beitragen können. Peritoneale Biopsien sowohl von urämischen Prädialysepatienten als auch von Patienten unter PD-Behandlung enthielten in Omentum und parietalem Peritoneum mehrheitlich FSP-1+ Thy-1+ HPFB. Im parietalen Peritoneum von nierengesunden Patienten fanden sich im Gegensatz hierzu keine FSP-1+ Fibroblasten, doch fanden sich im Omentum eine vergleichbare Anzahl Thy-1+ und Thy-1- Zellen. Diese Beobachtungen deuten an, daß die Population Thy-1+ Fibroblasten bei Patienten mit zunehmender Urämie sowie im Verlauf der Peritonealdialysetherapie zunehmen könnte. Insgesamt geben die Ergebnisse dieser Studie Hinweise auf eine Beteiligung von peritonealen Fibroblasten an inflammatorischen Prozessen im dialysierten Peritoneum und demonstrieren die Existenz einer Subpopulation von HPFB, die im Verlauf der Peritonealdialyse expandiert und zur Entwicklung einer peritonealen Fibrose beitragen kann.