Analysis of metabolic feedbacks regulating c-MYC

Abstract

The c-MYC (MYC) proto-oncogene is frequently activated in human cancer. Deregulated expression of MYC induces transcriptional imbalance, thereby driving a constitutive cell growth program that renders cancer cells dependent on the non-essential amino acid glutamine for survival, inducing ’glutamine addiction’. The thesis focused on MYC’s role as a nexus in metabolic re-programming by addressing the concept of glutamine addiction. We analyzed how limitations on external glutamine supply control MYC protein expression and thereby affecting MYC as a major regulator of cell growth, metabolism and apoptosis. Extensive time-resolved studies examining MYC regulation at various omics levels by the application of molecular biological, biochemical and mass spectrometry-based approaches allowed us to add another layer of information to MYC’s complex regulatory network. Contrary to MYC’s known function to regulate glutamine metabolism, we revealed MYC protein expression to be controlled by glutamine availability as a feedback mechanism in various cancer cell lines. We showed that the suppression of MYC protein expression in the absence of glutamine is mediated by its 3’-untranslated region (3’-UTR), which senses glutamine-dependent changes in adenosine nucleotide levels. The metabolic feedback protects cells from lethal glutamine addiction, while the activation of ectopic MYC in the absence of glutamine causes RNA polymerase II stalling and induces MYC-driven apoptosis. The concept of glutamine addiction has been described in experimental systems, that are predominantly based on the use of MYC transgenes, which usually lack the regulatory regions of the mRNA. Thus, this study underscores the need to include regulatory sequences into transgenes in in vivo and in vitro studies. We provided evidence that the MYC feedback is regulated at the post-transcriptional level, but is unlikely mediated by mRNA re-localization or mRNA decay via microRNAs. We identified several MYC 3’-UTR binding proteins as possible mediators. The most promising are currently evaluated for their role in the glutamine-mediated MYC regulation by siRNA screen. We speculated that the transcriptional stress caused by a disruption of the 3’-UTRmediated feedback might sensitize MYC-driven tumors to pro-apoptotic therapies. However, we found evidence that the inhibition of glutaminase, a common therapeutic approach to starve glutamine-addicted tumors, cannot suppress MYC protein expression. Accordingly, glutaminase inhibition might not be a suitable tool for novel combinatorial treatments, that induce synthetic lethality on the principle of glutamine addiction. We suppose that glutamine-utilizing transaminases might compensate for the inhibition of glutaminase. The majority of glutamine-converting transaminases are essential for de novo nucleotide biosynthesis. This bilateral function of transaminases might account for the double-sided MYC regulation via glutamine and adenosine-derived nucleotides.

Die Deregulierung des Onkogens c-MYC (MYC) trägt maßgeblich zur Entstehung einer Vielzahl humaner Tumore bei. Onkogenes MYC bedingt die Umstrukturierung metabolischer Prozesse und schafft somit die Voraussetzungen für ein unkontrolliertes Zellwachstum. In Folge dieser Umstrukturierung benötigen Krebszellen Glutamin, eine nichtessentielle Aminosäure, um fortan zu überleben. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle des Transkriptionsfaktors MYC in der metabolischen Umprogrammierung, die zur sogenannten Glutaminabhängigkeit führt, zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Aufgabestellung untersuchten wir mittels zeitaufgelöster Studien, basierend auf der Kombination molekularbiologischer, biochemischer und massenspektrometrischer Methoden, wie sich der Entzug von Glutamin auf die Regulation von MYC auswirkt. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass endogene MYC Proteinlevel durch die Verfügbarkeit von Glutamin reguliert werden. Wir beobachteten, dass die 3’-untranslatierte Region (3’-UTR) der MYC mRNA essentiell für die glutaminvermittelte Regulierung ist. Weiterhin zeigten wir, dass glutaminbedingte Veränderungen in Adenosinnukleotidleveln von der MYC 3’-UTR wahrgenommen werden. Dieser metabolische Kontrollmechanismus schützt Krebszellen unter Glutaminmangel vor MYC-induzierter Apoptose durch Hemmung der MYC Proteinexpression. Wir postulieren, dass dieser Mechanismus Probleme der Transkription bei niedrigen Nukleotidspiegeln verhindert, nachweisbar durch einen globalen Transkriptionsstopp auf Grund fehlender Rekrutierung der RNA Polymerase II. Die induzierte exogene MYC Expression unter Glutaminmangel hebt diese Blockade auf und führt zu MYC-induziertem Zelltod. Der metabolische Feedback-Mechanismus wurde bislang übersehen, da Untersuchungen zur Glutaminabhängigkeit zumeist auf dem Einsatz von MYC Transgenen basieren, die die 3’-UTR nicht beinhalten. Demnach sollten regulatorische Regionen zukünftig bei der Gestaltung von Transgenen berücksichtigt werden. Wir fanden Hinweise darauf, dass der glutaminabhängigeMYC Kontrollmechanismus posttranslational reguliert wird, jedoch weitestgehend unabhängig vom Abbau oder der Translokalisation der MYC mRNA stattfindet. Derzeitig werden die von uns identifiziertenMYC 3’-UTR bindenden Proteine mittels eines siRNA Screens auf ihre mögliche Beteiligung evaluiert. Wir vermuten, dass eine kombinierte therapeutisch induzierte Störung des Kontrollmechanismus und der Glutaminverstoffwechslung zu transkiptionellem Stress führt, welcher Krebszellen – basierend auf dem Konzept der Glutaminabhängigkeit – in die MYC-induzierte Apoptose treibt. Unter dieser Annahme untersuchten wir die MYC Proteinexpression in Abhängigkeit von Glutaminaseinhibitoren, konnten jedoch keine Beeinträchtigung feststellen. Wir postulieren, dass glutamineverstoffwechselnde Transaminasen wesentlich zu dieser Beobachtung beitragen. Viele dieser Transaminasen sind essentiell für den Nukleotidstoffwechsel und bedingen so möglicherweise MYCs bilaterale Regulation durch Glutamin und Adenosin.