Vergleichende in vitro Analyse von primären und immortalisierten Keratozyten anhand von Zytotoxizitätstests mit Konservierungsstoffen für Augentropfen

Abstract

Primäre Hornhautzellen sind aufgrund eines langsamen Wachstums, einer relativ kurzen Lebensspanne und einer hohen Kulturheterogenität in vitro nur schwer zu kultivieren. Daher könnten insbesondere Studien zur Prüfung pharmazeutischer sowie kosmetischer Produkte von immortalisierten Zellreihen aufgrund ihrer einfachen Kultivierung und einer besseren Vergleichbarkeit profitieren. Da die Zellreihe der immortalisierten Keratozyten (HCKi) eine neue Entwicklung darstellt, war das primäre Ziel dieser Arbeit der Vergleich primärer (HCKp) mit immortalisierten Keratozyten (HCKi) im Hinblick auf ihr Proliferations- und Toxizitätsverhalten. Es wurde untersucht, ob immortalisierte Keratozyten in Studien als Ersatz für primäre Zellen sowie für den Draize-Test zum Einsatz kommen sollten. Diese Studie ist nach bestmöglicher Literaturrecherche die bislang Zweite, die HCKp mit HCKi anhand von Zytotoxizitätstests vergleicht. HCKp und HCKi wurden hierfür nach einer Adhärenzphase von 24 Stunden mit Benzalkoniumchlorid (BAC) und Cetrimid (40-0,1μg/ml bzw. 100-0,01μg/ml) für 72 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden qualitativ und quantitativ unter dem Mikroskop bzw. mit einem Zellcounter ausgewertet. Es wurden die Zellzahl und die Vitalität der Zellen unter Berücksichtung der Verdopplungszeit eruiert. Mittels eines TUNEL-Hämatoxylin-Assays und eines Annexin-V-Propidiumiodid- Fluorescein-Assays wurde der Anteil apoptotischer Zellen bestimmt. Es zeigte sich, dass HCKi insbesondere für Vorversuche zur Festlegung von Toxizitätsgrenzen in Studien geeignet sind. Hierdurch kann der Gebrauch von HCKp und Tierversuchen auf ein Mindestmaß reduziert werden. Ganz ersetzen können sie primäre Zellen aber nicht, da sich zwischen beiden Zelllinien auch deutliche Unterschiede in Morphologie, Proliferationsverhalten und Sensitivität auf toxische Substanzen zeigten. HCKi weisen eine stärkere Widerstandsfähigkeit und eine erhöhte Regenerationsfähigkeit im Gegensatz zu HCKp auf.

Primary cornea-cells are difficult to cultivate because of a slow growth, a relatively short lifespan and a high culture- heterogeneity in vitro. Therefore, especially studies for the research of pharmaceutical and cosmetic products could take advantage of immortalized cell-lines because of their simple cultivation and their better comparability. As the cell-line of immortalized keratocytes (HCKi) represents a new development, the primary aim of this work was the comparison of primary keratocytes (HCKp) with immortalized keratocytes (HCKi) in view of their behaviour of proliferation and toxicity. It was examined if immortalized keratocytes should be used in studies as a replacement for primary cells as well as for the Draize test. To best of our knowledge, this study is the second one which compares HCKp and HCKi on the basis of toxicity tests. After an adherence phase of 24h HCKp and HCKi were cultivated with benzalkonium chloride (BAC) and cetrimide (40-0,1μg/ml and 100-0,01μg/ml respectively) for 72h. The cells were evaluated qualitatively and quantitatively under the microscope or with a cellcounter respectively. The cellnumber and the vitality of the cells was detected considering the doubling time. With a TUNEL-Haematoxylin-assay and an Annexin-V-Propidiumiodide-Fluorescein-assay the rate of apoptotic cells was determined. It was shown that HCKi are especially recommendable for preliminary experiments towards defining toxic limits in studies. Thus, the use of HCKp and animal tests can be reduced to a minimum. But they can’t replace primary keratocytes completely, as clear differences were shown between both cell-lines in their morphology, proliferation and sensitivity towards toxic substances. HCKi have a higher resistance and regenerative capacity in contrast to HCKp.