The Role of Bacillus subtilis Clp/Hsp100 Proteases in the Regulation of Swimming Motility and Stress Response

Abstract

The ATP–dependent proteases ClpCP and ClpXP are involved in general and regulatory proteolysis in the Gram–positive bacterium Bacillus subtilis. In general proteolysis, they degrade misfolded and aggregated proteins during stress and contribute to protein quality control, survival at high temperatures and thermotolerance together with chaperones. The same protease complexes act as key players in cellular regulation by controlled proteolysis of regulators. Regulatory proteolysis is important for gene regulation, signal transduction and differentiation into specialized cell types, such as endospores and competent cells. ClpCP and ClpXP are required for swimming motility in B. subtilis. The results presented in this work suggest that one function of ClpCP in motility regulation is to reduce the levels of the response regulator DegU, which acts as a repressor of motility genes. ClpXP positively regulates swimming motility by proteolysis of the oxidative stress regulator Spx. Furthermore, it could be demonstrated that Spx transiently downregulates motility genes when the regulator is stabilized during oxidative stress. Initial studies of the mechanism, by which Spx regulates motility genes imply that Spx acts indirectly by transcriptional activation of an unknown negative regulator of motility. In the second part of this study, the degradation of Hag, the structural component of the flagellum, was investigated. Hag was degraded in vitro by ClpCP assisted by the adaptor protein YpbH and protected from proteolysis by FliW. However, Hag was only degraded in the absence of the export chaperone FliS in vivo, which was independent of ClpP. These results suggest that two distinct pathways of Hag proteolysis exist, one of which may be important to prevent Hag aggregation or premature assembly, when its secretion is compromised. Spx was also shown to be required for thermotolerance, probably through the activation of unknown protective target genes. Furthermore, it was demonstrated that gsiB, mcsB and ywlE are important for thermotolerance development. Finally, evidence for a ClpP–independent function of ClpC in thermotolerance was acquired. Possibly, ClpC acts as a protein disaggregase, similar to ClpB and Hsp104.

Die ATP-abhängigen Proteasen ClpCP und ClpXP sind an der generellen und regulatorischen Proteolyse in dem grampositiven Bakterium Bacillus subtilis beteiligt. Im Rahmen der generellen Proteolyse bauen sie unter Stress falsch gefaltete und aggregierte Proteine ab und tragen gemeinsam mit Chaperonen zur Proteinqualitätskontrolle, zum Überleben bei hohen Temperaturen und zur Thermotoleranz bei. Die gleichen Proteasekomplexe beeinflussen die zelluläre Regulation durch kontrollierten Abbau von Regulatorproteinen. Regulatorische Proteolyse spielt eine wichtige Rolle bei der Genregulation, Signaltransduktion und bei der Differenzierung in spezialisierte Zelltypen wie Endosporen und kompetente Zellen. ClpCP und ClpXP sind essentiell für die Motilität von B. subtilis. Die hier gezeigten Daten sprechen dafür, dass eine Funktion von ClpCP während der Motilitätsentwicklung darin besteht, durch Proteolyse die Konzentration des Regulators DegU zu vermindern, der als Repressor von Motilitätsgenen wirkt. ClpXP reguliert die Motilitätsentwicklung durch Abbau des Redoxstressregulators Spx. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Spx die Motilitätsgene transient herunter reguliert, wenn der Regulator durch oxidativen Stress stabilisiert wird. Erste Ergebnisse zum Mechanismus der Spx-vermittelten Motilitätsregulation sprechen dafür, dass Spx indirekt durch Transkriptionsaktivierung eines unbekannten negativen Motilitätsregulators wirkt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Proteolyse von Hag, der Hauptstruktureinheit des Flagellums, untersucht. Hag wurde in vitro von ClpCP mit Hilfe des Adapterproteins YpbH abgebaut und von FliW vor der Proteolyse geschützt. In vivo wurde Hag jedoch nur in Abwesenheit des Exportchaperons FliS unabhängig von ClpP abgebaut. Diese Ergebnisse sprechen für die Existenz von zwei unterschiedlichen Wegen der Hag-Proteolyse. Einer dieser Wege könnte dazu dienen, die Aggregation oder verfrühte Assemblierung von Hag zu verhindern, wenn seine Sekretion gestört ist. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Spx für die Ausprägung der Thermotoleranz benötigt wird, wahrscheinlich durch Aktivierung unbekannter schützender Zielgene. Außerdem wurde gezeigt, dass gsiB, mcsB und ywlE wichtig für die Thermotoleranzentwicklung sind. Schließlich wurden Hinweise auf eine ClpP- unabhängige Funktion von ClpC in der Thermotoleranz gefunden. Möglicherweise wirkt ClpC als Proteindisaggregase, ähnlich wie ClpB und Hsp104.