Molecular mechanisms of cardioprotection by cord blood mesenchymal stromal cells

Abstract

Objective: Mesenchymal stromal cells (MSC) are currently being evaluated for supportive treatment of ischemic heart disease. The aim of the present work was to determine the paracrine effects of human umbilical cord blood-derived MSCs (CBMSC) on ischemic cardiomyocytes and endothelial cells and to characterize the relevant intracellular signaling pathways. Furthermore, hypoxic preconditioning (HP) was evaluated as a strategy to optimize the performance of CBMSCs under ischemic conditions. Methods: CBMSCs were incubated in glucose/serum-free medium at 1% O2 to simulate ischemic conditions in vitro. The thus conditioned medium was collected and analyzed for secreted pro-survival proteins. Murine HL-1 cardiomyocytes and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were subjected to individually adapted in vitro ischemia protocols, where the effects of CBMSC conditioned medium on apoptosis, viability and proliferation were tested. Phosphorylation of AKT, ERK and STAT3 was determined, and its functional relevance for cytoprotection was confirmed by small-molecule inhibitor experiments. The MSC specificity of effects was assessed by use of medium conditioned by human fibroblasts. Finally, CBMSCs were hypoxically preconditioned prior to the actual “ischemic” challenge, and the anti-apoptotic and pro-angiogenic effects of HP were investigated. Results: CBMSC conditioned medium contained HGF, VEGF, EGF, FGF-basic, angiopoetin-2 and IL-6 and counteracted apoptosis of HL-1 cardiomyocytes and HUVECs subjected to ischemia-like conditions. In HL-1 cardiomyocytes, survival signals were transmitted by the kinases AKT and ERK in a compensatory manner. This effect was in part specific to CBMSCs. In HUVECs, the beneficial effects were mediated by STAT3. Here, fibroblast conditioned medium possessed similar anti-apoptotic and pro-mitotic potency. Hypoxic preconditioning increased the survival and pro-angiogenic action of CBMSCs under ischemia-like conditions. This was associated with anti-apoptotic AKT signaling and expression of BCL-XL and BAG. Conclusion: CBMSC released factors protect cardiac cells from ischemic damage by activating distinct anti-apoptotic signaling pathways, but this effect is only in part MSC- specific. HP improves the performance of CBMSCs in an ischemic environment and might thus be a useful strategy to enhance the efficacy of MSCs in cardiac cell therapy in a readily translatable fashion.

Zielsetzung: Mesenchymale Stromazellen (MSC) werden gegenwärtig zur unterstützenden Behandlung von ischämischer Herzkrankheit evaluiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die parakrinen Effekte von humanen MSCs aus Nabelschnurblut (CBMSC) auf ischämische Kardiomyozyten und Endothelzellen zu bestimmen und die relevanten intrazellulären Signalwege zu identifizieren. Zudem sollte evaluiert werden, ob Überleben und Wirksamkeit von CBMSCs unter ischämischen Bedingungen durch hypoxische Präkonditionierung (HP) gesteigert werden können. Methoden: CBMSCs wurden in Glukose/Serum-freien Medium bei 1% O2 inkubiert um ischämische Bedingungen in vitro zu simulieren. Das so konditionierte Zellkulturmedium wurde abgenommen und auf sezernierte Überlebensfaktoren untersucht. Murine HL-1 Kardiomyozyten und humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) wurden individuell angepassten Ischämieprotokollen unterzogen, in denen die Effekte des CBMSC-konditionierten Mediums auf Apoptose, Viabilität und Proliferation untersucht wurden. Die Phosphorylierung von AKT, ERK und STAT3 wurde bestimmt und die funktionelle Relevanz dieser Signalwege für den jeweiligen Zelltyp mittels Small-Molecule- Inhibitoren bestätigt. Durch zusätzliche Verwendung von Fibroblasten- konditioniertem Medium wurde die MSC-Spezifität der Effekte bestimmt. Abschließend wurden CBMSCs vor der simulierten Ischämie hypoxisch präkonditioniert und die anti-apoptotischen und pro-angiogenen Effekte der Präkonditionierung untersucht. Ergebnisse: CBMSC-konditioniertes Medium enthielt HGF, VEGF, EGF, FGF-basic, angiopoetin-2 und IL-6 und wirkte der Apoptose von HL-1 Kardiomyozyten und HUVECs unter Ischämie-ähnlichen Bedingungen entgegen. In HL-1 Kardiomyozyten vermittelten die Kinasen AKT und ERK in kompensatorischer Weise den Überlebensstimulus; dieser Effekt war teilweise CBMSC-spezifisch. In HUVECs wurden die positiven Effekte durch STAT3 vermittelt, hier zeigte Fibroblasten-konditioniertes Medium vergleichbare anti-apoptotische und pro-mitotische Wirkung. HP steigerte das Überleben und die pro-angiogene Wirkung von CBMSCs unter Ischämie-ähnlichen Bedingungen. Diese Effekte waren mit anti-apoptotischem AKT-Signalling und der Expression von BCL-XL und BAG assoziiert. Schlussfolgerung: CBMSC-sezernierte Faktoren beschützen kardiale Zellen vor ischämischer Schädigung durch Aktivierung von anti-apoptotischen Signalwegen; dieser Effekt ist jedoch nur teilweise CBMSC- spezifisch. HP verbessert die Wirksamkeit von CBMSCs in ischämischer Umgebung und könnte daher eine nützliche Strategie sein, die Effizienz kardialer Zelltherapie zu steigern.