Go-Protein vermittelte Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme und dessen Einfluss auf das monoaminerge Neurotransmittersystem

Abstract

Vorangegangene Studien führten zu einem Modell der präsynaptischen Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme. In diesem Modell wird davon ausgegangen, dass der vesikuläre Monoamintransporter (VMAT) wie ein G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPCR) funktioniert und das Vesikel-assoziierte heterotrimere Go2-Protein aktiviert, welches in einer negativen Rückkopplungsschleife direkt oder indirekt über nachgeschaltete Effektoren die vesikuläre Monoaminaufnahme verringert. Diese Regulation ist damit möglicherweise über die Justierung der Quantengröße auf vesikulärer Ebene an der Feinabstimmung des monoaminergen Neurotransmittersystems beteiligt. Dieser Signalweg wird über die vesikuläre Monoaminkonzentration gesteuert. Wenn eine ausreichende vesikuläre Konzentration erreicht ist, sind verschiedene Monoamine in der Lage die GPCR- ähnliche Funktion des VMAT über dessen große luminale Schleife zu aktivieren. Zentrale Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine Interaktion zytoplasmatischer VMAT2-Domänen mit der Goalpha-Untereinheit und mit Gbeta, wie es für einen GPCR erwartet wird. Diese Ergebnisse liefern damit die Grundvoraussetzung dafür, dass der VMAT eine GPCR-ähnliche Funktion besitzt. Hierfür kamen molekularbiologische Methoden zum Einsatz, wie z. B. das Yeast Two-Hybrid- und das GST-Pulldown-Verfahren. Am Maus-Modell konnte über die Deletion der Goalpha-Splice-Isoform Go1alpha bzw. Go2alpha ein Zusammenhang zur striatalen Dopamin-Homöostase hergestellt werden. Go1alpha-/- Mäuse zeigen ein gegenüber Wildtyp-Mäusen erhöhtes striatales Dopamin-Niveau, während dieses in Go2alpha-/- Mäusen vermindert ist. Dabei ist zu beachten, dass in Go1alpha-/- Mäusen die Go2alpha-Expression im Vergleich zum Wildtyp erhöht ist. In der Doppelmutante (Go1/2alpha-/-) dagegen ist das Dopamin-Niveau ausgeglichen. Dies legt eine Wechselwirkung des Go1alpha und der Go2alpha-Signaltransduktion zur Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme bezüglich der Dopamin- Homöostase nahe. Eine Folge der Störung der Dopamin-Homöostase ist ein verändertes motorisches Verhalten der Tiere. Go2alpha-/- Mäuse zeigen allerdings erst unter wiederholter Verabreichung von Psychostimulanzien (Amphetamin, Kokain) Veränderungen bezüglich ihrer motorischen Aktivität im Vergleich zum Wildtyp. Die Go1alpha-Deletionsmutante ist dagegen bereits ohne Einfluss von Psychostimulanzien stark beeinträchtigt. Diese Störung wird über das zusätzliche Deletieren des Go2alpha (Go1/2alpha-/-) im Vergleich zu Go1alpha-/- Mäusen gemildert. Letzteres spiegelt sich auch in der Überlebenschance der Tiere wieder. Während Go2alpha-/- Mäuse eine den Wildtyp- Tieren entsprechende Entwicklung zeigen, sind Go1alpha-/- und Go1/2alpha-/- Mäuse stark wachstumsretardiert und weisen eine verkürzte Lebensspanne auf. Auch hier ist dieser Phänotyp der Go1/2alpha-Deletionsmutante gegenüber Go1alpha-/- Mäusen weniger stark ausgeprägt. Wir schließen daraus, dass Go1alpha überlebensnotwendig ist, aber eine veränderte Go2alpha-Expression über eine folgliche Fehlregulation der vesikulären Monoaminaufnahme bezüglich des Überlebens, der striatalen Dopamin-Homöostase und damit der motorischen Aktivität einen großen Einfluss besitzt. Eine Beeinträchtigung der Dopamin- Homöostase resultiert zudem in Krankheiten wie Schizophrenie, Depression und weiteren affektiven Störungen (Übersicht von Beaulieu und Gainetdinov, 2011). Damit sind die Goalpha-Splice-Isoformen geeignete Kandidaten für eine Analyse im Bezug auf Dopamin-basierte Krankheiten und könnten neue Zielmoleküle für therapeutische, pharmakologische Ansätze darstellen.

Previous studies led to a model which suggests a role for the presynaptic regulation of the vesicular monoamine uptake in fine-tuning the monoaminergic neurotransmitter system by adjusting its quantal size on the vesicular level. In this model it is believed, that the vesicular monoamine transporter (VMAT) functions like a G protein coupled receptor (GPCR) and activates the vesicle associated heterotrimeric Go2 protein, which in turn attenuates the vesicular monoamine uptake in a negative feedback loop either directly or indirectly by downstream effectors. This signal pathway is regulated by the vesicular monoamine content. Is the vesicular concentration sufficient, different monoamines are capable of activating the GPCR-like function of the VMAT via its large luminal domain. Here, in this work essential results show a physical interaction of cytoplasmic VMAT2 domains with the Go protein alpha-subunit and Gbeta, obtained by biomolecular methods, such as the yeast two hybrid and the GST pulldown assay. Thereby, these results provide the basic requirement for the VMAT to own a GPCR-like function, further confirming our model. In mice, deletion of the Goalpha splice isoform Go1alpha and Go2alpha, respectively, results in a disturbance of the striatal dopamine homeostasis. Go1lalpha-/- mice show an increased striatal dopamine level in comparison to wild type mice, whereas it is decreased in Go2alpha-/- mice. Here it is worth mentioning, that the Go2alpha expression is increased in Go1alpha-/- mice compared to wild type. In contrast, the double mutant (Go1/2alpha-/-) shows a balanced dopamine level. From this we conclude, that there might be a cross talk between Go1alpha and the Go2alpha signal transduction, which regulates the vesicular monoamine uptake, regarding dopamine homeostasis. In Goalpha deletion mutants the disturbed dopamine homeostasis results in altered motor activity. Whereas Go2alpha-/- mice only show changes in their motor activity compared to wild type animals after repeated treatment with psychostimulants (amphetamine, cocaine), the Go1alpha deletion mutant shows strong motor impairments even without drug application. The motor impairment is less pronounced in double knockouts (Go1/2alpha-/-) compared to Go1alpha-/- mice. A similar effect is seen when assessing the survival rates of these animals. While Go2alpha-/- mice develop similar to wild type animals, Go1alpha-/- and Go1/2alpha-/- mice are strongly growth retarded and display a shortened life span. This phenotype is less prominent in the Go1/2alpha deletion mutant compared to Go1alpha-/- mice. We conclude, that Go1alpha is crucial for survival, but that altered expression of Go2alpha and consequently a misregulated vesicular monoamine uptake have a significant influence on survival, striatal dopamine homeostasis and therefore on regulating motor activity. In addition a disturbed dopamine homeostasis results in diseases like schizophrenia, depression and other affective disorders (reviewed by Beaulieu and Gainetdinov, 2011). Thus for the analysis of dopamine-based disorders Goalpha splice isoforms are suitable candidates that could be new targets for therapeutical, pharmacological studies.