G protein-coupled peptide receptors as molecular targets in neuroendocrine tumors

Abstract

Effective cancer therapy relies on early diagnosis and treatment decisions based on patient-specific tumor profile and biology. Peptide receptor targeting proved to be a pivotal tool for imaging, staging and therapy of neuroendocrine tumors, which frequently express G protein-coupled somatostatin receptors (SSTRs) on their cell surface. Optimized somatostatin analogs such as octreotide are successfully utilized for the clinical management of these tumors. However, it is estimated that around 30 % of patients do not profit from SSTR-based approaches, making the characterization of alternative cell surface targets necessary. Previous cell-based screening assays conducted in our group had shown a clear response of human NET cell lines to angiotensin II. In the presented study, expression analyses of the cognate angiotensin II receptor type 1 (AGTR1) revealed an upregulation of both mRNA and protein levels in patient NET tissues compared to healthy controls. To assess the applicability of AGTR1 for in vivo imaging, the receptor ligands saralasin and valsartan were coupled to the near-infrared dye ITCC and tested for their biodistribution in a mouse model bearing receptor-positive and -negative xenograft tumors. Both probes showed promising results and represent a good basis for further development to optimize their physicochemical profile as well as tumor accumulation. Functional assays evaluating signaling cascades and processes such as proliferation and secretion upon receptor stimulation complemented this project. Diagnostic imaging selects eligible patients with SSTR-positive tumors for following peptide receptor radionuclide therapy (PRRT). For this purpose, somatostatin analogs are coupled to therapeutic radionuclides like lutetium-177, which are specifically bound and uptaken by NETs after injection. Although PRRT can deliver radiation doses of up to 250 Gy to the tumors, complete remission is very rare. The additional use of established NET therapies such as targeted mTOR inhibition can be a promising approach. Therefore, the second part of this study assessed a potential radiosensitizing effect of temsirolimus and everolimus in five NET cell line models. Treatment with these mTOR inhibitors alone resulted in antiproliferative effects, modulation of downstream signaling and G1 cell cycle arrest. On the other hand, undirected external beam irradiation induced a G2/M arrest in all tested cell lines. In combination, mTOR inhibitors abrogated the radiation-induced G2/M arrest with further reduction of cell viability and survival. As the investigated NET cell lines revealed a lack of SSTR2 expression, two receptor-positive cell lines were established for further SSTR2-targeted PRRT studies. Although the combination of mTOR inhibitors with the agonistic 177Lu-DOTATOC did not reveal any beneficial effect, the superiority of the recently developed antagonist 177Lu-DOTA-JR11 was demonstrated. This work contributes to the understanding of NET-specific target expression and treatment response. The obtained insights might be further refined by preclinical studies to pave the way for a significant increase of the diagnostic and therapeutic efficacy.

Entscheidend für eine effektive Krebstherapie sind die rechtzeitige Diagnose und eine Behandlungsstrategie, die auf den jeweiligen Patienten und sein Tumorprofil abgestimmt wird. Die zielgerichtete Erkennung von Peptidrezeptoren spielt für die Bildgebung und Therapie von neuroendokrinen Tumoren (NETs) eine zentrale Rolle. NETs exprimieren auf ihrer Zelloberfläche häufig G-Protein-gekoppelte Somatostatin-Rezeptoren (SSTRs), die den klinischen Einsatz optimierter Somatostatin-Analoga wie Octreotid ermöglichen. Allerdings profitieren Schätzungen zufolge etwa 30 % der Patienten nicht von SSTR-basierten Ansätzen. Dies macht die Charakterisierung alternativer Oberflächenrezeptoren notwendig. In Screening-Experimenten mit NET-Zelllinien ergaben sich erste Hinweise auf eine potentielle Rolle von Angiotensin II und dem Angiotensin-II-Rezeptor Typ 1 (AGTR1). Die vorgelegte Arbeit bestätigte dies durch weitere Analysen an humanen NET-Proben. Im Vergleich zu gesunden Kontrollen wiesen NET-Gewebe eine erhöhte Gen- sowie Proteinexpression des AGTR1 auf. Des Weiteren wurde die Eignung des Rezeptors für die optische Bildgebung überprüft. Dazu wurden die AGTR1-Liganden Saralasin und Valsartan an den Nahinfrarotfarbstoff ITCC gekoppelt und in einem NET-Mausmodell auf ihre Bioverteilung untersucht. Beide Konjugate zeigten vielversprechende Ergebnisse und bilden eine gute Basis für eine weitere Optimierung. Die Analyse von Liganden-induzierten Signalwegen sowie Proliferation und Sekretion rundeten dieses Projekt ab. Die diagnostische Bildgebung ermöglicht die Identifikation von Patienten mit SSTR-positiven Tumoren, die für eine folgende Peptidrezeptor-Radiotherapie (PRRT) in Frage kommen. Zu diesem Zweck werden Somatostatin-Analoga an ein therapeutisches Radionuklid wie Lutetium-177 gekoppelt. Obwohl dadurch bis zu 250 Gy selektiv den Tumor erreichen ist eine vollständige Remission selten. Die Kombination mit etablierten NET-Therapien wie mTOR-Inhibitoren ist daher ein vielversprechender Ansatz. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher an fünf NET-Zelllinien unterschiedlichen Ursprungs untersucht, inwieweit die mTOR-Inhibitoren Temsirolimus und Everolimus radiosensibilisierend wirken. Beide Substanzen wirkten antiproliferativ und führten zur Modulation beteiligter Signalwege sowie zum G1-Zellzyklusarrest. Im Gegensatz dazu hatte die ungerichtete externe Bestrahlung in allen Zelllinien einen G2/M-Arrest zur Folge. In der Kombination verringerten die mTOR-Inhibitoren den strahlungsinduzierten G2/M-Arrest und reduzierten Zellviabilität und -überleben stärker als mit der jeweiligen Monotherapie. Da in den verwendeten NET-Zelllinien keine SSTR2-Expression nachgewiesen werden konnte, wurden für die folgenden Versuche mit zielgerichteter Radiotherapie zwei SSTR2-positive NET-Zelllinien etabliert. Die kombinierte Behandlung mit mTOR-Inhibitoren und dem agonistischen Radiopeptid 177Lu DOTATOC ließen im verwendeten Modell zwar keinen Vorteil erkennen, allerdings konnte die Überlegenheit des kürzlich entwickelten Antagonisten 177Lu-DOTA-JR11 demonstriert werden. Die vorliegende Arbeit leistet somit einen Beitrag zum besseren Verständnis der NET-spezifischen Rezeptorexpression und zur Evaluierung möglicher neuer Therapieansätze. Die gewonnenen Ergebnisse erfordern eine weitere Validierung durch präklinische Studien, um die Effizienz von Diagnose und Therapie in Zukunft zu verbessern.