Regulatorische T-Zellen als adjuvante Therapie der akuten Graft versus Host Erkrankung im xenogenen Maus-Modell

Abstract

Allogene Stammzelltransplantationen werden zur Therapie maligner und nicht-maligner Erkrankungen des hämatopoetischen Systems genutzt. Die Zahl der Transplantationen ist über die letzten Jahre kontinuierlich gestiegen. Trotz intensiver Forschung und Weiterentwicklung sind akute und chronische Abstoßungsreaktionen weiterhin maßgeblich für den Erfolg einer Stammzelltransplatation limitierend. Die klassische Immunsuppression kann Patienten oft nur unzureichend vor der Erkrankung schützen. Zudem ist die Behandlung mit einer Reihe unerwünschter Wirkungen verbunden. Regulatorische T-Zellen sind natürliche Immunmodulatoren. Sowohl in experimentellen wie auch klinischen Untersuchungen konnte der Zusammenhang zwischen regulatorischen T-Zellen und dem klinischen Verlauf nach Stammzelltransplantation und Transplantation solider Organe gezeigt werden. Für eine eventuelle klinische Anwendung ist neben der Etablierung von Expansionsprotokollen unter GMP-Bedingungen, auch die Untersuchung auf das Zusammenspiel mit konventionellen Immunsuppressiva unerlässlich. In der vorliegenden Arbeit wurde durch Applikation von 3*106 humanen PBMCs in NOD/SCID Il-2Rgamma -/- Mäusen an Tag 0 eine xenogene akute GvHD induziert. Zur weiteren Therapie wurden ab Tag +1 Ciclosporin A, Mycophenolat-Mofetil oder Methylprednisolon sowohl als Monotherapie, als auch in Kombination mit 0,5*106 polyklonal expandierten nTreg appliziert. Zusätzlich wurden nTreg in verschiedenen Dosierungen (1,5*106, 3*106 und 6*106) zusammen an Tag 0 mit den humanen PBMCs als Monotherapie ohne zusätzliche Immunsuppression appliziert. Post mortem wurden die Gewebe auf die Infiltration humaner Zellen und den Anteil an FoxP3+ Treg untersucht. Histologisch wurden die Organe auf Infiltration und Inflammation untersucht. Die Behandlung mit Treg als Monotherapie resultierte unter einer Dosis von 1:1 und 1:2 (3*106 und 6*106), nicht aber 2:1 (1,5*106) in einer Verbesserung der Überlebensdauer und der klinischen Erscheinung. Überraschenderweise resultierte vor allem die Behandlung mit Ciclosporin A und nTreg in einem verbesserten klinischen Verlauf und verlängerten Überleben. Vor allem in der Leber führte die Therapie zu einem erhöhten Anteil FoxP3+ Treg bei einer jedoch insgesamt verringerten Gesamtmenge humaner Zellen im Gewebe. Interessanterweise resultierte die Kombinationstherapie aus Pred./nTreg im Vergleich zur Monotherapie bei einigen Tieren in schnellem Gewichtsverlust, schlechtem klinischen Befinden und reduziertem Anteil an FoxP3+ Treg im Gewebe. Schlussfolgernd führten sowohl die Monotherapie mit nTreg 1:1 und 1:2, nicht aber 2:1 zu einem verlängerten Überleben der Tiere im Vergleich zur erkrankten Kontrolle. Anders, als bisher immer wieder gezeigt, resultierte die Behandlung mit Ciclosporin A, vor allem in Kombination mit nTreg nicht in einer Inhibiton der regulatorischen Zellen, sondern in einem erhöhten Anteil FoxP3+ Treg im Gewebe, vor allem in der Leber. Die Ergebnisse legen damit vielmehr einen synergistischen, proliferationssteigernden Effekt von CsA auf Treg nahe. Die Therapie mit MMF, ebenso wie die Kombinationstherapie aus Methylprednisolon und nTreg konnten hingegen nicht ausreichend vor einer akuten GvHD schützen.

Transplantation of allogeneic stem cells is a curative therapy for malignant and nonmalignant disease of the hematopoetic system. The number of transplantations increased continuously over the last years. Despite intensive research and developments in that field acute and chronic rejection remain major limitations for successful stem cell transplantation. Classical immunosuppression is often insufficient to protect patients from disease. Furthermore, the therapy itself is accompanied with several undesired side effects. Regulatory t-cells are natural immunomodulators. Experimental studies, as well as patient data show a connection between regulatory t-cells and the outcome of stem cell and solid organ transplantation. For possible clinical application, establishing of GMP-grade isolation and expansion protocols as well as the analysis of the interplay of Treg with conventional immunosuppressants is inevitable. In the present study, xenogeneic acute GvHD was induced by application of 3*106 humane PBMCs into NOD/SCID Il-2Rgamma -/- mice on day 0. Further therapy included application of cyclosporine a, mycophenolate-mofetil or methylprednisolone, alone or in combination with 0.5*106 polyconal expanded nTreg, from day +1 on. Additionally, nTreg were injected in different dosages (1,5*106, 3*106 und 6*106) on day 0 together with the PBMCs as monotherapy without further immunosuppression. Post mortem, tissues were analyzed for infiltration of humane cells and the amount of FoxP3+ Treg. The organs were analyzed for infiltration and inflammation histologically. Therapy with nTreg alone resulted in prolonged survival and increased clinical appearance only with effector cells / nTreg ratio 1:1 and 1:2, but not 2:1. Surprisingly, especially the treatment with CsA plus nTreg resulted in an increased clinical extending and prolonged overall survival. Especially the liver showed an increased number of FoxP3+ Treg with decreased overall cell numbers of humane cells at the same time. Interestingly, the treatment with methylprednisolone plus nTreg resulted in fast deterioration in some animals, marked by fast weight loss and a reduced number of FoxP3+ Treg within the tissue. This picture differed a lot from what could be observed in mice under therapy with methylprednisolone only. In conclusion, treatment with regulatory t-cells in a ratio 1:1 and 1:2, but not 2:1 compared to diseased animals. Different from what was mostly shown, the treatment with CsA, especially in the combination with nTreg did not inhibit the regulatory cells. Instead it resulted in an increased amount of FoxP3+ Treg within the tissue, especially in the liver. These results show much more a synergistic, proliferation promoting effect of cyclosporine a on Treg. On the other hand the treatment with MMF, as well as the combination of methylprednisolone and nTreg could not sufficiently protect from an acute GvHD.