Selektive multiphotonische Anregung von Fluorophoren mit phasen- und polarisationsgeformten Laserpulsen

Abstract

Das Ziel der Dissertation war es, die Nutzung polarisationsgeformter Pulse für die selektive mehrphotonische Fluoreszenzanregung zu untersuchen. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Verfahren gezeigt, das es ermöglicht, bei endoskopischen Anwendungen, bei denen eine Detektion des Pulses am Faserausgang nicht möglich ist, die Pulsform eines durch eine Hollow-Core- Faser transmittierten Pulses aus einer Rückreflexion des Pulses durch die Faser zu berechnen. Besonders gut funktioniert das Verfahren bei geformten Pulsen, die aus linear entlang den Achsen der Faser polarisierten Subpulsen bestehen. Um die Form von Subpulsen, die durch die Überlagerung zweier entlang jeweils einer der beiden Achsen polarisierten Pulse generiert werden, korrekt zu berechnen, ist hingegen eine deutlich höhere Messgenauigkeit nötig. Jedoch sind für viele Anwendungen, z.B. die selektive Anregung zweier unterschiedlicher Prozesse entlang unterschiedlicher Polarisationsrichtungen oder die kohärente Kontrolle von Molekülen mit Pi-Sigma-Übergängen, gerade Pulse aus orthogonal linear polarisierten Subpulsen von Bedeutung. Im zweiten Teil der Arbeit wurden solche polarisationsgeformten Pulse benutzt, um in einer Mischung aus zwei Farbstoffen beide unter unterschiedlichen Polarisationsrichtungen selektiv anzuregen und ihre Fluoreszenz polarisationsabhängig zu trennen. Nachdem für mehrere Farbstoffe sowohl die Anisotropie in Glycerin als auch die Möglichkeit zur selektiven Anregung mit geformten Pulsen untersucht wurde, wurde hierfür schließlich eine Mischung aus Rhodamin B und Stilben 3 hergestellt. Dabei zeigte sich, dass Stilben 3 zwei verschiedene orthogonal polarisierte Fluoreszenzbänder besitzt, wodurch die gemessene Anisotropie von der Fluoreszenzwellenlänge abhängt. Diese Abhängigkeit ermöglicht es, mit dieser Mischung verschiedene Fälle zu testen. Es konnte gezeigt werden, dass bei stark unterschiedlichen Anisotropien der beiden Fluorophore in der Mischung, bereits bei der Anregung mit einem transformlimitierten, linear polarisierten Puls starke Änderungen des Kontrastes in Abhängigkeit von der Polarisationsrichtung auftreten. Bei Fluorophoren gleicher Anisotropie war es erst durch Verwendung polarisationsgeformter Pulse, möglich eine polarisationsabhängige Kontraständerung zu erzeugen. Im dritten Teil der Arbeit wurde dann untersucht, ob die selben Methoden, die zur selektiven Anregung bei zweiphotonischer Absorption benutzt wurden, auch für die dreiphotonische Absorption funktionieren. Dies wurde durch die selektive Anregung der beiden Laserfarbstoffe BM-Terphenyl und p-Terphenyl experimentell bestätigt. Im letzten Teil der Dissertation wurde dann der Aufbau einer Apparatur zur Erzeugung superfluider Heliumtröpfchen gezeigt. Die Untersuchung der Dynamik von in den Tröpfchen eingelagerten Alkalidimeren und Alkali-Helium-Exciplexen mit Methoden der kohärenten Kontrolle war eigentlich das ursprüngliche Thema dieser Dissertation. Aufgrund zahlreicher Verzögerungen und mangelnder Finanzierung war es im Rahmen der Dissertation jedoch nicht möglich, über das Fertigstellen der Apparatur und erste Vorexperimente hinaus noch Experimente zur kohärenten Kontrolle mit evolutionären Optimierungen durchzuführen. Der nächste wichtige Schritt wäre die Nutzung der in dieser Arbeit entwickelten Methoden bei einer fluoreszenzmikrospischen Anwendung. Dies wird vermutlich in Zusammenarbeit mit der AG Heyne geschehen, in der ein Zweiphotonenmikroskop aufgebaut wurde, bei dem sowohl Phasen- und Amplitudenformung zur selektiven Anregung eingesetzt werdensollen als auch räumliches Shapen mit einem 2D- Pulsformer, um durch STED (Stimulated Emission Depletion) die Auflösung zu verbessern. Ziel dieses Projekts ist es, bei der Zweiphotonenmikroskopie von Gewebe eine bessere Tiefenauflösung zu erreichen. Ein anderes geplantes Projekt ist die Untersuchung und Kompensation des Einflusses der Transmission durch eine Kagome-Faser auf die Pulsform. Dieser Typ von photonischer Kristall-Faser erlaubt die Transmission von Licht in einem deutlich größeren Wellenlängenbereich als die in dieser Arbeit verwendete Hohlkernfaser und würde es ermöglichen die angeregte Fluorezenz durch die Faser zurückzureflektieren. Ebenfalls interessant wäre die Verwendung des in unserer Arbeitsgruppe entwickelten Aufbaus zur Erzeugung geformter Weißlichtpulse für die selektive Anregung, die auf Grund ihrer höheren Bandbreite noch höhere Kontraständerungen ermöglichen könnten. Zuletzt könnte auch die Übertragung der in Kapitel 5 gezeigten Methode zur Beeinflussung des polarisationsabhängigen Kontrastes durch polarisationsgeformte Pulse unter Ausnutzung der Anisotropie auf dreiphotonische Fluorophore interessant sein.

Aim of this thesis was to investigate the feasibility to use polarization shaped pulses for selective multiphotonic fluorescence excitation. In the first part of the thesis a method is demonstrated to reconstruct the shape of a pulse after transmission through a hollow core photonic crystal fiber by recording the back reflection through the fiber. This method is particularly important for applications where detection of the pulse at the output of the fiber is not possible, for example in endoscopic examinations in medicine. This method works particularly well for shaped pulses consisting of sub-pulses linearly polarized along the optical axes of the fiber. But fortunately, those pulses are of importance for many applications, e.g. for the selective excitation of two different processes along different directions of polarization or for the coherent control of molecules with pi-sigma- transitions. The reconstruction of the shape of pulses generated by superposing two sub-pulses each of which travelling along the fiber at different optical axes needs a significantly higher exactness of measurement. In the second part of this thesis this kind of polarization-shaped pulses are used for the selective excitation of two different fluorescence dyes in the same mixture in different directions of polarization followed by the separation of the fluorescence signal in dependence of their polarization. A mixture of Rhodamine B and Stilbene 3 was prepared for the tests after investigating the anisotropy of a variety of dyes in glycerol and also the possibility for their selective excitation with shaped pulses. Stilbene 3 displayed two different orthogonally polarized fluorescence bands. This dependency allows testing of different cases with this mixture. Thus strong polarization dependent changes in contrast could be demonstrated for mixtures of fluorophores with highly different anisotropies, even following excitation by a transform-limited, linearly polarized pulse. However it was only possible to induce polarization depended changes of the contrast in fluorophores of the same anisotropy by using polarization-shaped pulses. In the third part of the investigation it was tested whether the methods used for the selective excitation at two photonic absorption can also be used for three photonic absorptions. This could be confirmed in experiments by the selective excitation of the two laser dyes BM-terphenyl and p-terphenyl. In the final part of the thesis an apparatus for the generation of super fluid helium droplets doped with alkali atoms was deviced. The investigation of the dynamics of alkali dimers and alkali helium exciplexes embedded in this kind of droplets by methods of coherent control has been the original subject of this thesis. In the context of this thesis it was only possible to build the devices and to perform some basic experiments due to numerous delays and the lack in funding. The next important step using the methods developed in this thesis would be the development of an application in fluorescence microscopy. This will probably be achieved in cooperation with Prof. Dr. Heyne, FU Berlin. His group has developed a two-photon microscope which makes it possible to combine phase and amplitude shaping for selective excitation as well as spatial shaping with a 2D pulse shaper for improving the resolution by STED (Stimulated Emission Depletion). The aim of this project is to achieve a better depth resolution in two-photon microscopy of tissues. Another project envisaged is the investigation of the influence of transmission through a Kagome-fiber on pulse shape and its compensation. This type of photonic crystal fiber is able to transmit light of a much wider range of wavelengths than the hollow-core fiber used in this investigation. The Kagome-fiber type would allow to reflect the excited fluorescence back through the fiber to its origin. Another project of interest would be to perform selective excitation experiments with the set-up for the generation of shaped white-light pulses, developed by our group. This would provide higher contrast changes due to the greater bandwidth of the pulses. Last but not least it would be interesting to transfer of the method presented in Chapter 5 to manipulate the polarization- dependent contrast by polarization-shaped pulses by exploiting the anisotropy on three photonic fluorophores.