Genotyping and antibiotic resistance of thermophilic Campylobacter isolates from Vietnam and Kenya

Abstract

Thermophilic Campylobacter are well recognized as the leading cause of bacterial foodborne gastroenteritis worldwide. Campylobacter are microaerophilic growing, Gram-negative, curved corkscrew shaped and show motility. They colonize the intestine of many wild and domestic animals, particularly that of poultry. The review on Campylobacter shows specific aspects of Campylobacter/campylobacteriosis including: (i) taxonomy of the genus Campylobacter, growth and survival characteristics; (ii) detection, isolation and confirmation of Campylobacter; (iii) poultry as natural hosts for Campylobacter species as zoonotic pathogens and (iv) antimicrobial resistance in Campylobacter (Chapter 1). Knowledge on Campylobacter is limited in many developing countries, particularly in Southeast Asia. The review covering published articles from 1971 to 2016 in Cambodia, Laos and Vietnam showed them as neglected bacterial pathogens. Literature on prevalence of thermophilic Campylobacter in humans showed a prevalence up to 11% in Vietnam while it was even higher in Cambodia and Laos. Especially, children under five years of age were affected. Animals and food as source for human infections play an important role. Carriage of Campylobacter by different animal species and contamination rate of meat are generally high and can reach more than 70%. Resistance to antibiotics is of public health concern. High rates of resistance to nalidixic acid, erythromycin, tetracycline and ciprofloxacin were detected in up to 100% of isolates (Chapter 2). Nine isolates (eight C. jejuni and one C. coli) isolated from meat were identified by multiplex PCR, and tested for the presence or absence of 29 gene loci associated with virulence, lipooligosaccharide (LOS) biosynthesis and further functions. flaA typing, multilocus sequence typing and investigation by microarray assay showed a high degree of genetic diversity among these isolates. In all isolates motility genes (flaA, flaB, flhA, fliM), colonization-associated genes (cadF, docB), toxin genes (cdtA, cdtB, secD, secF), and LOS biosynthesis gene pglB were detected. Eight gene loci could not be detected by PCR. Different gene loci for ciaB (22.2 %), Cje1280 (77.8 %), docC (66.7 %), and cgtB (55.6 %) were found. iamA, cdtC, and the type 6 secretion system were present in all C. jejuni isolates but not in C. coli. flaA typing resulted in five different genotypes within C. jejuni, MLST classified the isolates into seven sequence types. The microarray assay analysis showed also high genetic diversity within Vietnamese Campylobacter isolates which resulted in eight different types for C. jejuni. Antibiotic susceptibility profiles showed that all isolates were sensitive to gentamicin and most isolates (88.8 %) were sensitive to chloramphenicol, erythromycin and streptomycin. Resistance rates to nalidixic acid, tetracycline and ciprofloxacin were 88.9 %, 77.8 % and 66.7 %, respectively. This is the first report that shows high genetic diversity and remarkable antibiotic resistance of Campylobacter strains isolated from meat in Vietnam. These strains can be considered of high public health significance (Chapter 3). Antibiotic susceptibility of thermophilic Campylobacter isolates which were collected from Kenya were tested using the broth microdilution assay. Molecular biological detection of genes associated with resistance completed the results. Thermophilic Campylobacter was identified in 53 samples by PCR (34 C. jejuni, 18 C. coli and one mix of both species) but only 35 Campylobacter isolates (31 C. jejuni and 4 C. coli) could be recultivated after transportation to Germany. C. jejuni isolates showed a high rate of resistance to nalidixic acid, tetracycline and ciprofloxacin of 77.4 %, 71.0 % and 71.0 %, respectively. Low resistance (25.8 %) was detected for gentamicin and chloramphenicol. Multidrug resistance in C. jejuni could be detected in 19 (61.3 %) isolates. Resistance patterns of C. coli isolates were comparable. Resistance to ciprofloxacin was confirmed by MAMA-PCR and PCR-RFLP in all phenotypically resistant isolates. The tet(O) gene was detected only in 54.5 % of tetracycline resistant C. jejuni isolates. The tet(A) gene, which is also responsible for tetracycline resistance, was found in 90.3% of C. jejuni and in all C. coli isolates. Thirteen phenotypically erythromycin resistant isolates could not be characterized by using PCR-RFLP and MAMA-PCR. This study showed a high level of resistance to ciprofloxacin, nalidixic acid and tetracycline but also a remarkable one to chloramphenicol and gentamicin and multidrug resistance seems to be a prevalent problem. Resistance to antibiotics is of global public health concern. In Kenya, resistance surveillance needs further attention (Chapter 4).

Thermophile Campylobacter werden als häufigste Ursache bakteriell bedingter, durch Lebensmittel verursachte Gastroenteritiden weltweit angesehen. Campylobacter wachsen als gekrümmte Stäbchen unter mikroaerophilen Bedingungen, sind Gram-negativ und beweglich. Sie kolonisieren den Verdauungstrakt vieler Wildvögel und den von geflügels. Ein Überblick über Campylobacter zeigt verschiedene Aspekte im Komplex Campylobacter/Campylobakteriose, wobei folgendes berücksichtigt wird: (i) die Taxonomie der Gattung Campylobacter mit Wachstumsbedingungen und Überlebenscharakteristika, (ii) die Isolierung, den Nachweis bzw. die Bestätigung von Campylobacter-Spezies, (iii) Geflügel als natürlichen Wirt für die zoonotischen Pathogene Campylobacter und (iv) die Empfindlichkeit von Campylobacter - Isolaten gegenüber verschiedenen Antibiotika (Kapitel 1). Der Kenntnisstand bezüglich Campylobacter und deren Verbreitung, Eigenschaften, Antibiotikaresistenz usw. in Entwicklungsländern ist häufig mangelhaft. Dies trifft auch auf Südostasien zu. Der Übersichtartikel über Campylobacter aus publizierten Beiträgen von 1971 bis 2016 zeigt diese Erreger als vernachlässigte bakterielle Pathogene in Kambodscha, Laos und Vietnam. Die Literatur bezüglich der Prävalenz thermophiler Campylobacter beim Menschen und als Ursache von Durchfallerkrankungen zeigt eine Prävalenzrate von bis zu 11% in Vietnam. Diese ist in Kambodscha und Laos noch höher. Besonders betroffen von Campylobakteriosen sind Kinder im Alter bis zu 5 Jahren. Umgang mit Tieren und Lebensmittel spielen bei Infektionen des Menschen eine wesentliche Rolle. Verschiedene Tierarten können die Erreger übertragen und die Kontaminationsraten von Fleisch sind generell hoch und können bis 70% erreichen. Auch die Antibiotika-Resistenz von Campylobacter-Isolaten hat eine große Bedeutung für den Gesundheitssektor. Hohe Resistenzraten gegenüber Nalidixinsäure, Ciprofloxacin, Erythromycin und Tetrazyklin wurden beobachtet und wurden manchmal bei 100 % der Isolate festgestellt (Kapitel 2). Neun vietnamesische Campylobacter-Isolate (8 C. jejuni und ein C. coli), welche als Kontaminanten bei Fleisch von Hühnern und Schweinen gewonnen wurden, konnten durch Multiplex-PCR identifiziert werden. Sie wurden auf die An- oder Abwesenheit von 29 Genorten getestet. Diese Orte sind mit der Virulenz, der Lipooligosaccharid-Synthese und weiterer Funktionen assoziiert. Durch flaA- Typisierung, „Multi locus sequence typing“ (MLST) und Mikroarray-Analyse konnte ein hohes Maß an genetischer Heterogenität unter den Isolaten ermittelt werden. Alle Isolate trugen bestimmte Motilitätsgene, Kolonisierungs- assoziierte und Toxin-Gene sowie das Lipooligosaccharid- Biosynthese-Gen pglB. Auch ein Typ-VI-Sekretionssystem war bei allen C. jejuni-Isolaten nachweisbar, nicht jedoch bei dem C. coli-Isolat. Acht Genorte wurden durch PCR- Untersuchungen in keinem Isolat gefunden. Mehrere Gene waren in unterschiedlichem Maße präsent. flaA-Typisierung ergab 5 verschiedene Genotypen für die C. jejuni-Isolate, MLST sieben Sequenztypen. Die Mikroarray- Analyse bestätigte die starke Heterogenität. Alle Isolate waren empfindlich gegenüber Gentamicin und auch weitgehend sensibel gegenüber Chloramphenicol, Erythromycin und Streptomycin. Die Resistenzraten gegenüber Nalidixinsäure, Tetrazyklin und Ciprofloxacin betrugen 88,9%, 77,8% und 66,7%. Dieser erste Bericht zeigte eine hohe genetische Heterogenität und eine bemerkenswerte Antibiotika-Resistenz der Campylobacter-Isolate, welche auf einem Markt in Hanoi, Vietnam gewonnen wurden. Die Befunde sind von öffentlichem Interesse (Kapitel 3). Die Antibiotika-Empfindlichkeit thermophiler Campylobacter- Isolate, welche in bäuerlichen Geflügelhaltungen in Kenia gewonnen wurden, wurde mittels Mikrodilutionsverfahren ermittelt. Die molekularbiologische Detektion von Resistenzdeterminanten komplettierten die Resultate der phänotypischen Tests. Thermophile Campylobacter wurden mittels PCR in 53 Fällen identifiziert (34 C. jejuni, 18 C. coli, eine Mischkultur). Leider konnten nur 35 Isolate nach dem Transport nach Deutschland rekultiviert werden. Sie zeigten eine hohe Resistenzrate gegenüber Nalidixinsäure, Tetrazyklin und Ciprofloxacin mit 77,4%, 71, 0% und 71,0%. Eine niedrigere Resistenzrate wurde für Gentamicin und Chloramphenicol festgestellt. Resistenz gegenüber verschiedenen Antibiotikaklassen (multidrug resistance) wurde in 61,3% der Isolate gefunden. Die Resistenz gegenüber Ciprofloxacin wurde durch MAMA-PCR und PCR-RFLP bestätigt. Das tet(O)-Gen wurde nur in 54,5% der Tetrazyklin-resistenten Isolate gefunden. Das tet(A)-Gen, welches ebenfalls Resistenz gegenüber Tetrazyklin vermittelt, wurde in 90,3% der Isolate detektiert. Die Bestätigung der Erythromycin-Resistenz der phänotypisch resistenten Isolate durch MAMA-PCR und PCR-RFLP mißlang. Insgesamt wurde ein hohes Maß an Antibiotika-Resistenz bei den Campylobacter-Isolaten aus Kenia festgestellt, wobei vor allem die Multiresistenz der Bakterien ein Problem darstellt, welches von globalem Interesse ist. Für Kenia gilt es, Überwachungsprogramme hinsichtlich der Ausbildung von Antibiotika-Resistenzen zu etablieren (Kapitel 4).