Molecular detection and characterization of tick-borne pathogens of cattle in Southwestern Ethiopia

Abstract

Tick-borne diseases (TBDs) affect 80% of the world’s cattle population, hampering livestock production throughout the world. Bovine babesiosis, anaplasmosis, heartwater and theileriosis have all been reported to occur in Ethiopia. However, little is known about the extent and prevalence of these diseases in the local cattle population. The principal aim of this thesis was to estimate the species composition and prevalence of bovine tickborne pathogens (TBPs) in Southwestern Ethiopia. The first paper of this cumulative thesis deals with the evaluation of six DNA extraction methods from blood spotted on Flinders Technology Associates (FTA) cards, to determine the optical protocol for the subsequent molecular detection of TBPs by PCR and reverse line blot (RLB) hybridization. Ten-fold serial dilutions of bovine blood infected with Babesia bovis, Theileria mutans, Anaplasma marginale or Ehrlichia ruminantium were made by dilution with uninfected blood and spotted on FTA cards. Subsequently, DNA was extracted from FTA cards using six different DNA extraction protocols. Additionally, DNA was also isolated from whole blood dilutions using a commercial kit. The findings from this study showed that (i) among the methods compared, the highest detection limit was observed when DNA was extracted from FTA cards using FTA purification reagent combined with elution with 5% Chelex® 100 resin. Secondly, the detection limit was improved when more discs were used as starting material for the DNA extraction, whereby the use of sixteen 3 mm discs proved to be most practical, (iii) comparisons of the detection limits of RLB and PCR for the four TBPs of cattle showed that the sensitivity of DNA extraction from FTA card vary between different TBPs and the sensitivity of the RLB was in nearly all instances 10x higher compared to gel electrophoresis. The second study aimed to determine the prevalence and species composition of bovine TBPs of veterinary significance in local cattle populations of Illubabor zone in Southwestern Ethiopia. The best method for the extraction of DNA from blood spotted on FTA cards as described above and a combination of PCR and a Reverse Line Blot (RLB) hybridization assay were employed for the detection of a broad-spectrum of TBPs (i.e. Babesia, Theileria, Anaplasma and Ehrlichia spp.) in blood samples collected from 392 cattle. The findings showed a high prevalence of several bovine TBPs in Southwest Ethiopia, some which are of great veterinary importance. Individual prevalences of these pathogens included Theileria mutans (66.1%), Theileria orientalis (51.8%), Anaplasma sp. Omatjenne (25.5%), Anaplasma marginale (14.5%), Babesia bigemina (14.0%) and Theileria velifera (13.0%) and minor occurrences of Ehrlichia ruminantium (0.5%) and Ehrlichia minasensis (0.26%). Ehrlichia minasensis was until now only reported from North and South America. In addition, three novel Anaplasma genotypes were detected in bovine blood samples. A phylogenetic analysis revealed that they most likely represent three, but at least two, new species. A total of 227 cattle (57.9%) were found to be coinfected with two or more TBPs simultaneously and 86 different species combinations were observed. The high frequency of co-infections observed in this study suggests that clinical manifestations might be complex and complicate their diagnosis. The data presented in this thesis provides a more informed picture of the epidemiology of infection of cattle with TBPs and contributes towards integrated and strategic control of ticks and TBDs in Ethiopia.

Zecken-übertragene Krankheiten (TBDs), welche 80 % der weltweiten Rinderpopulation betreffen, haben einen negativen Einfluss auf die Nutzviehwirtschaft auf der ganzen Welt. Das Vorkommen der Babesiose, Anaplasmose, Herzwasserkrankheit und Theileriose bei Rindern in Äthiopien wurde beschrieben. Allerdings ist wenig bekannt über die Bedeutung und die Prävalenz dieser Krankheiten in den lokalen Rinderpopulationen Äthiopiens. Ziel dieser Dissertation war es daher, die Spezieszusammensetzung und die Prävalenz der von Zecken übertragenen Pathogene (TBP) in Rindern im Südwesten von Äthiopien zu bestimmen. Die Dissertation gliedert sich in zwei Studien. Die erste Studie beschäftigt sich mit der Evaluierung von sechs DNS-Extraktionsmethoden. Eine Zehner-Verdünnungsreihe von Rinderblut, das mit Babesia bovis, Theileria mutans, Anaplasma marginale oder Ehrlichia ruminantium infiziert war, wurde durch Verdünnung mit nicht infiziertem Blut hergestellt und auf FTA-Karten („Flinders-Technology-Associates“ cards) übertragen. Anschließend wurde die DNS unter Verwendung von sechs verschiedenen DNS-Extraktionsmethoden aus den FTA-Karten extrahiert. Zusätzlich wurde vergleichend DNS aus den Proben mit einem handelsüblichen Extraktions-Kit isoliert. Ziel war es, das optimale Protokoll für eine sich anschließende molekulare Erfassung der von Zecken übertragenen Pathogene durch PCR und „Reverse-Line-Blot-Hybridisierung“ (RLB) zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass (i) unter den verglichenen Methoden die höchste Nachweisempfindlichkeit für die Erreger erreicht wurde, wenn die DNS aus FTAKarten unter Verwendung der FTA-Reinigungslösung, kombiniert mit der Elution mit 5% Chelex® 100-Harz, extrahiert wurde. Zweitens wurde die Nachweisgrenze verbessert, wenn mehrere Stanzproben von den FTA-Karten der gleichen Probe als Ausgangsmaterial für die DNS-Extraktion verwendet wurden, wobei die Verwendung von sechzehn 3 mm-Stanzproben sich als am praktischsten erwies. (iii) Vergleiche der Nachweisgrenzen von RLB und PCR für die durch Zecken übertragenen Pathogene für Rinder zeigten, dass die Empfindlichkeit der DNS-Extraktion aus den FTA-Karten zwischen verschiedenen TBPs variierte und die Empfindlichkeit der RLB-Hybridisierung in fast allen Fällen 10x höher war als im Vergleich zur Gelelektrophorese. In der zweiten Studie sollte die Prävalenz und Spezieszusammensetzung der TBPs in den lokalen Rinderpopulationen in der Region von Illubator, im Südwesten von Äthiopien, bestimmt werden. Die Extraktionsmethode mit der höchsten Nachweisempfindlichkeit (FTA-Reinigungslösung kombiniert mit 5% Chelex® 100-Harz) wurde in Kombination mit der PCR und einem RLB-Hybridisierungsassay für die Detektion eines breiten Spektrums von TBPs angewandt. Insgesamt wurden Blutproben von 392 Rinder auf die Erreger aus vier TBP-Gattungen untersucht (Babesia spp., Theileria spp., Anaplasma spp. und Ehrlichia spp.). Die Ergebnisse zeigen eine hohe Prävalenz mehrerer Rinder-TBPs in Südwest-Äthiopien, von denen einige eine große veterinärmedizinische Bedeutung haben. Die Prävalenz dieser Pathogene betrug für Theileria mutans (66,1%), Theileria orientalis (51,8%), Anaplasma sp. Omatjenne (25,5%), Anaplasma marginale (14,5%), Babesia bigemina (14,0%), Theileria velifera (13,0%), Ehrlichia ruminantium (0,5%) und Ehrlichia minasensis (0,26%). Ehrlichia minasensis war zuvor ausschließlich in Rinderproben aus Nord- und Südamerika nachgewiese worden. Zusätzlich wurden drei neue Anaplasma-Genotypen in Rinderblutproben identifiziert. Eine phylogenetische Analyse zeigte ferner, dass diese höchstwahrscheinlich drei, zumindest aber zwei, neue Arten darstellen. Insgesamt waren 227 Rinder (57,9%) mit zwei oder mehreren TBPs gleichzeitig infiziert. Dabei wurden 86 verschiedene Spezieskombinationen beobachtet. Die in dieser Studie beschriebene Häufigkeit von Ko-Infektionen deutet darauf hin, dass klinische Manifestationen komplex sein können und daher eine Diagnose verkomplizieren können. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten ergeben einen Überblick über das Artenspektrum und die Prävalenz der von Zecken übertragenen Pathogene bei Rindern im Südwesten von Äthiopien. Die epidemiologischen Daten liefern eine wichtige Voraussetzung für eine strategische und nachhaltige Kontrolle der Zecken und der durch sie im Untersuchungsgebiet übertragenen Erreger.