Hochdurchsatz-Sequenz-Analyse zur Identifikation von prädisponierenden sowie somatischen Mutationen bei Patienten mit Nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC) zur Vorhersage von Chemotherapie-Resistenzen

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden somatische- und Keimbahnmutationen bei Bronchialkarzinom-Patienten identifiziert, die möglicherweise für eine Chemotherapie-Resistenz der Patienten verantwortlich sind. Dazu wurden Patienten-abgeleitete Xenograft-Modelle und das primäre Normalgewebe von 23 Nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom-Patienten verwendet, und das jeweilige Mutationsprofil durch zielgerichtete Hochdurchsatz- Sequenzierung generiert. Hierfür war es zunächst erforderlich, die Technologien für klinisches Gewebematerial zu etablieren. Diesbezüglich konnte gezeigt werden, dass sowohl Gefriermaterial als auch in Formalin fixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe für die zielgerichtete Anreicherung und Sequenzierung verwendet werden können. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass eine geringe DNA-Menge ausreicht, um eine gute Sequenzierungs- und Anreicherungseffizienz zu erhalten. Unterschiedliche Biopsien eines Primärtumors besitzen ein identisches Profil der Einzelnukleotidvarianten. Bei Analysen der Kopienzahlvarianten muss aber die Tumorheterogenität von unterschiedlichen Biopsien beachtet werden. Die Ergebnisse der Mutationsanalyse der Xenografts bestätigten die hohe Mutationsfrequenz, die dem Bronchialkarzinom zugrunde liegt. Bezugnehmend auf die somatischen Mutationen und die somatischen Kopienzahlvarianten konnte eine hohe Übereinstimmung zwischen dem Xenograft-Tumor und dem Primärtumor erzielt und dadurch bestätigt werden, dass Patienten-abgeleitete Xenograft-Modelle für die Mutationsanalyse verwendet werden können. Anhand von Sensitivitätstests der 23 Xenograft-Modelle auf unterschiedliche Chemotherapien wie Carboplatin, Gemcitabin, Paclitaxel und Cetuximab konnten Mutationen identifiziert werden, die vermutlich für intrinsische Resistenzen verantwortlich sind. Unter anderem konnten biologische Prozesse und Genkandidaten aufgezeigt werden, die bisher mit noch keinem intrinsischen Resistenzmechanismus assoziiert wurden. Beispielsweise wurden in dem p21-aktivierenden (PAK)-Signalweg signifikant viele somatische Mutationen in den Carboplatin-resistenten Tumoren identifiziert. Bezüglich einer Gemcitabin-Resistenz wurden in den Tumoren u. a. viele Mutationen in dem FGFR-Signalweg identifiziert, die mit einer verringerten Sensitivität gegen das Therapeutikum assoziiert sind. Für beide Signalwege existieren Inhibitoren, die nun untersucht werden sollten, ob sie eine Carboplatin- bzw. Gemcitabin-Resistenz aufheben können. Hinsichtlich einer Resistenz gegenüber dem EGFR Inhibitor Cetuximab konnten u. a. das Hitzeschockprotein HSP90AB1 und der Wachstumsfaktor HGF als sehr interessante Genkandidaten identifiziert werden, die in einem Zusammenhang mit Chemotherapie-Resistenzen gebracht werden können. Funktionelle Experimente ergaben Hinweise darauf, dass MAML2, CDC42BPA und KMT2D einen Einfluss auf die Sensitivität gegenüber dem EGFR Inhibitor Cetuximab haben könnten. Abschließend erfolgte eine erste Integration unterschiedlicher Datensätze, um Auswirkungen der identifizierten KMT2D Mutationen zu ermitteln. Interessanterweise zeigten Tumore mit Mutationen im KMT2D Gen, das für eine Histon-Methyltransferase kodiert, signifikante Veränderungen der Genexpression und der DNA-Methylierung, die mit der Chemotherapie-Resistenz in Verbindung gebracht werden können. Schlussendlich wurden die generierten Datensätze in ein mathematisches Vorhersagemodell implementiert, um in einem ersten systembiologischen Ansatz eine Vorhersage zur Wirkstoffwirkung zu ermöglichen. Hierbei zeigten erste Ergebnisse von zwei Tumoren eine sehr gute Übereinstimmung der Sensitivität der Xenograft-Mäuse und der in silico Vorhersage der Wirksamkeit von Cetuximab. Die Modellierung soll nun auch für die weiteren 21 Patienten, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht worden sind, durchgeführt werden. Falls für diese ebenfalls eine gute Übereinstimmung zwischen den experimentellen Daten und den in silico Modellierungen existieren sollte, hätte dies zweifellos weitreichende Konsequenzen für die zukünftige Therapie von Patienten mit Nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom.

In this thesis, the mutation profile of somatic- and germline mutations of 23 patient-derived xenograft-models and the corresponding normal tissues of non- small-cell lung cancer patients were generated. For this, a customer target high throughput re-sequencing approach was used. However, these technologies needed to be further improved with regard to reproducibility and applicability to clinical samles and settings. It could be shown that formalin-fixed paraffin embedded tissue material can supplement fresh frozen tissues for the detection of single nucleotide variants and that solution-based enrichment experiments can be accomplished with small amounts of DNA. Finally, the question was to addressed whether the heterogeneity of a tumor is reflected by different genetic alterations, e.g. if different foci of a tumor display different genomic patterns. It could be shown that the tumor heterogeneity plays an important role mainly for the detection of copy number alterations. The results of the mutation analysis confirmed the high mutation rates that underlie lung cancer diseases. As a technical proof-of-principle experiment it could be shown that somatic mutations and somatic copy number alterations depicted a high overlap between the xenograft-tumor and the primary tumor and confirmed that patient-derived xenograft-models can be used for genetic analysis. Sensitivity tests for 23 xenografts-models were performed for different chemotherapies like Carboplatin, Gemcitabine, Paclitaxel, and Cetuximab. For these, mutations could be identified which might be responsible for intrinsic resistances. For example, the p21-activated (PAK) signaling pathway was significantly affected by somatic mutations in Carboplatin resistant tumors. In regard to Gemcitabine, many mutations within the FGFR signaling pathway were associated with a reduced sensitivity of the mice. Concerning a resistance for the EGFR inhibitor Cetuximab, the heat shock protein HSP90AB1 and the hepatocyte growth factor HGF could be identified as gene candidates transmitting a chemotherapy resistance. Functional assays were performed which provide first evidence that MAML2, CDC42BPA and KMT2D are involved in the resistance to the EGFR inhibitor Cetuximab. Since KMT2D is a histone methyltransferase, a data integration approach was used to identify its functional relevance. Interestingly, for resistant tumors with KMT2D mutations significant changes in gene expression and DNA methylation were measured. In the end, the generated datasets were integrated in a computer prediction tool (PyBios) with the aim to establish a systems biology network for therapy responses. First preliminary results in two tumors confirmed a high concordance between the chemotherapy sensitivity of the xenografts mice and in silico prediction. These modelling will now be extended to the 21 patients analyzed in this thesis. In case that the experimental data and the in silico modelling remains with a high concordance (high predictive value for the in silico modelling) this approach will have without doubt, an important consequence for the therapy of patients with non-small-cell lung cancer in the future.