Pathomechanismus Clostridium perfringens Enterotoxin-vermittelter Schädigung des Kolon-Epithels und Generierung neuartiger Toxin-Varianten zur Therapie Claudin überexprimierender Tumoren

Abstract

Lebensmittelvergiftungen durch Clostridium perfringens Typ A sind weit verbreitet. C. perfringens Enterotoxin (CPE) gilt hier als wichtigster Verursacher gastrointestinaler (GI) Symptome und spielt zudem eine Rolle bei Antibiotika-assoziierter Diarrhö. Das β-Poren-formende Toxin schädigt Zellen in Dünndarm und Kolon. Es bindet über die C-terminale Domäne (cCPE) an seine Rezeptoren – einige (z.B. Claudin-3, -4, -7) aber nicht alle (z.B. Claudin-1, -5) Mitglieder der Tight-Junction(TJ)-Proteinfamilie der Claudine (Cldn1-27). Durch CPE-Poren einströmendes Ca2+ führt dann zum Zelltod. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des Pathomechanismus CPE-vermittelter Schädigungen des Kolon-Epithels sowie die Generierung neuartiger Toxin-Varianten für die Claudin-gerichtete Therapie von Tumoren. Es zeigte sich, dass nur eine Subpopulation von Enterozyten des Kolon-Epithels CPE-sensitiv ist. Entscheidend ist hierfür die Lokalisation des CPE-Rezeptors Cldn4: Während Cldn4 in CPE-insensitiven Zellen für eine CPE-Bindung unzugänglich in TJs vorlag, ist es bei CPE-sensitiven Zellen im apikalen, dem Darmlumen zugewandten Plasmamembrankompartiment lokalisiert, wo es CPE als Angriffspunkt dient. Störung der epithelialen Barriere durch den inflammatorischen Faktor TNFα, EGTA oder Dedifferenzierung erhöhte die Zugänglichkeit von CPE- Rezeptoren und so die CPE-Sensitivität. Diese mechanistischen Daten erklären, wie CPE in Einzelfällen zu schwerwiegenden Manifestationen wie intestinalen Nekrosen führen kann, wenn die intestinale Barriere – z.B. bei Entzündung – gestört und so der Zugang zu Claudinen erleichtert ist. Neben seiner Rolle in GI-Pathologien besitzt CPE großes Potential in der Krebsmedizin, denn in vielen Tumoren werden Claudine überexprimiert. Bei Therapie solcher Tumoren wirken allerdings zwei Faktoren limitierend: (i) Da auch in gesundem Gewebe – wie Leber und Niere – CPE-Rezeptoren zugänglich sind, kann es zu Nebenwirkungen kommen. (ii) Nur Tumoren, die CPE-Rezeptoren, nicht aber solche die andere Claudine (Nicht-CPE-Rezeptoren wie Cldn1 und -5) überexprimieren, können angegriffen werden. CPE-Varianten, deren claudinspezifische Toxizität auf das Claudinexpressionsprofil des jeweiligen Tumors zugeschnitten ist, könnten diese Limitierungen überwinden helfen. Dass sich die claudinspezifische Toxizität gezielt über strukturgeführte Mutationen in CPE verändern lässt, wurde hier gezeigt. Mit CPE-L254A/S256A/I258A/D284A konnte eine CPE-Variante generiert werden, die toxische Effekte bevorzugt über Bindung an Cldn4 und kaum über andere CPE-Rezeptoren vermittelt. Die Mutationen S305P/S307R/S313H und Y306W/S313H erlauben eine Bindung an die Nicht-CPE-Rezeptoren Cldn1 und -5. Mit entsprechenden CPE-Varianten konnten toxische Effekte, über Nicht-CPE-Rezeptoren wie Cldn1 und -5 vermittelt werden. Schließlich konnte CPE-S305P/S307R/S313H erfolgreich in vitro eingesetzt werden, um Cldn1-exprimierende Thyroidkarzinomzellen (K1) anzugreifen, die aufgrund fehlender CPE-Rezeptorclaudine insensitiv gegenüber CPE-wt sind. Dies demonstriert das Potential optimierter CPE-basierter Biologika. Hierauf aufbauend können künftig weitere CPE-basierte Tumortherapeutika und -diagnostika generiert werden.

Food poisoning caused by Clostridium perfringens type A is common. C. perfringens enterotoxin (CPE) is responsible for its gastrointestinal (GI) symptoms and also plays a role in antibiotic-associated diarrhea. The β-pore- forming toxin damages epithelial cells in the small intestine and the colon. As cellular receptors serve some (e.g. claudin-3, -4, -7) but not all (e.g. claudin-1, -5) claudins – a family of tetraspan membrane proteins (Cldn1-27). Ca2+-influx through CPE-pores leads to cell death. This study aimed to investigate the mechanism of CPE-induced damage to the colonic epithelium and to generate novel CPE-variants for claudin-targeted cancer therapy. This work demonstrates that only a subpopulation of colonic enterocytes is sensitive towards CPE. CPE sensitivity depends on localization of CPE receptor Cldn4: In insensitive cells Cldn4 was found inaccessible for CPE binding at the TJ. In CPE-sensitive cells Cldn4 was localized in the apical membrane compartment. Facing the lumen of the gut it here is easily accessible for CPE. If the epithelial barrier was disturbed by inflammatory factor TNFα, EGTA or dedifferentiation, enhanced accessibility of CPE receptors led to enhanced CPE sensitivity. These mechanistic details provide an explanation of how CPE sometimes may lead to severe clinical manifestations like intestinal necrosis if claudin accessibility is facilitated by a disturbed intestinal barrier – e.g. during inflammation. Besides its role in GI pathologies CPE bears great potential in cancer medicine, as claudins are frequently overexpressed in tumors. However, tumor therapy using CPE has its limitations: (i) as claudins are also expressed in healthy tissue (e.g. liver and kidney) there are side effects. (ii) Only tumors expressing CPE receptors but not those overexpressing other claudins (such as Cldn1 or -5) can be targeted. Novel CPE variants with claudin subtype specific affinities, which are tailored to the claudin expression profiles of distinct tumors could help to overcome these limitations. Here it is demonstrated that claudin subtype specific toxicity can be altered by structure-based site directed mutagenesis. CPE variant CPE- L254A/S256A/I258A/D284A preferentially mediates toxicity via Cldn4 but barely via other CPE receptors. Mutations S305P/S307R/S313H and Y306W/S313H allow binding to non-CPE receptors Cldn1 und -5. Accordingly, the respective CPE variants allowed to mediate a toxic effect via Clnd1 and -5. Finally, CPE- S305P/S307R/S313H was successfully used in vitro to target Cldn1-expressing thyroid carcinoma cells (K1), which were insensitive towards CPE-wt due to lack of high levels of CPE receptor claudins. These results demonstrate the potential of optimized CPE-based biologicals and may serve as foundation for further developments in the field of CPE-based therapeutics and diagnostics.