Effects of ephrinB2 – EphB4 signaling on spinal metastasis

Abstract

Introduction The incidence of spinal metastasis has been increasing constantly over the last 20 years as a consequence of improved diagnostics and oncological therapy. Spinal metastases require extensive surgical intervention in the case of spinal instability or in the presence of a neurological deficit, which impose a significant burden to pa-tients. While surgical procedures are becoming more and more complex for treating spinal metastasis, the molecular principles remain elusive. EphB4 – ephrinB2 has been linked to organ-specific tumor cell dissemination by mediating tumor cell – en-dothelial cell adhesion and repulsion. In this study we investigated the effect of EphB4 – ephrinB2 interaction on B16 tumor cell dissemination and long-term metas- tasis formation. Methods B16-F1 melanoma were lentivirally infected with a firefly luciferase, green fluores-cence protein, puromycin resistance construct (B16-luc). Spinal metastasis of these cells were explanted and recultivated (mB16-luc). EphB4 was retroviraly overex-pressed in B16-luc (B16 -luc-EphB4). The cells were in-vitro characterized for prolif-eration (MTT), migration (wound healing) and EphB4 gene expression (qPCR / Im-munoblot). After retrograde left carotid artery injection, metastasis formation was ob- served by in-vivo bioluminescence imaging. Spinal metastases were identified by T2 small animal magnetic resonance imaging. Number of disseminated cells / metasta-sis was measured after tissue homogenization using ex-vivo bioluminescence. The experiments were performed in wild type and inducible endothelial ephrinB2 knock-out animals (iΔefnb2). Results Endothelial ephrinB2 depletion (1738 ± 806 cells) or EphB4 kinase inhibition (1009 ± 334 cells), led to increased tumor cell dissemination. EphB4 overexpression reduced osseous dissemination of tumor cells (bone: 322 ± 90 cells other: 612 ± 206 cells). In long-term metastasis experiments, the time to neurological deficit was significantly reduced in iΔefnb2 animals (iΔefnb2 median: 21 days, control median: 26 days). Number of spinal metastasis (control: 1.2 ± 0.4472, iΔefnb2: 3.2 ± 1.643) and tumor volume (control: 2.815mm3 ± 2.558mm3 and iΔefnb2 9.999mm3 ± 5.596mm3) was significantly increased in iΔefnb2 mice. In contrast, EphB4 overexpression signifi-cantly reduced spinal metastasis number (B16-luc- pLXSN: 1.4 ± 0.5477, B16-luc-EphB4: 0.4 ± 0.5477). Secondary metastatic tumor cells (mB16-luc) lead to in-creased, organ unspecific cell dissemination. Long-term metastasis showed faster neurological deficits (B16-luc median: 26 days, mB16-luc median: 22 days), higher number of spinal metastasis (B16-luc 1.2 ± 0.4472, mB16-luc 3.8 ± 1.643) and in-creased tumor volume in the spine (B16-luc 2.815mm3 ± 2.558mm3 and mB16-luc 9.209mm3 ± 5.561mm3). Conclusion We found generally increased aggressiveness of sequential metastatic cells in- vivo. Endothelial ephrinB2 depletion mediates metastasis formation to the spine and may predispose to increased metastasis formation in osseous organs. EphB4 overex-pression on tumor cells decreased spinal metastasis. This research helps facilitate the development of a priory-targeted therapy for spinal metastasis.

Einführung Die Entstehung klinisch relevanter spinaler Metastasen ist in den vergangenen 20 Jahren stetig gestiegen. Diese Prognose limitierende onkologische Manifestation kann momentan nicht suffizient therapiert werden. Die molekularen Mechanismen, welche dieser Krankheit zu Grunde liegen, sind weitestgehend unbekannt. Tumorzell – Endothelzell-Interaktionen vermitteln die Extravasation von Tumorzellen und nehmen damit bei der Entstehung von Metastasen eine entscheidende Rolle ein. Der EphrinB2-ephB4 Signalweg vermittelt in diesem Zusammenhang Tumorzell – Endothelzell-Interaktionen und könnte damit eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie dieser Erkrankung einnehmen. In dieser Studie wurde der Effekt des EphrinB2-ephB4-Systems auf die Dissemination von B16 Melanomzellen und die Manifestation von spinalen Metastasen untersucht. Methodik Luziferase infizierte B16-F1 Melanomzellen (B16-luc) sowie EphB4 überexprimieren-de Tumorzellen (B16-luc-EphB4) wurden retrograd über die Arteria carotis interna in die Aorta descendens injiziert. Spinale Metastasen dieser Zellen wurden explantiert und rekultiviert (mB16-luc). Alle Zellen wurden in-vitro auf Proliferation (MTT), Migra-tion (Wundheilungs assay) und Genexpression von EphB4 (qPCR / Immunoblot) charakterisiert. Die Metastasenbildung wurde mittels in-vivo Biolumineszenzbildge-bung überwacht. Bei Nachweis spinaler Metastasen wurden die Größe und Anzahl mittels T2 Kleintier-Magnetresonanztomographie charakterisiert. Anschließend wurden die Organe extrahiert. Mittels Gewebehomogenisation sowie anschließender Lumineszenzanalyse wurde die Anzahl disseminierter Tumorzellen bzw. metastati-scher Tumorzellen pro Organ bestimmt. Die Experimente wurden in Kontrollen und induzierbaren endothelspezifischen ephrinB2 knockout Tieren (iΔefnb2) durchge-führt. Ergebnisse Die Depletion von ephrinB2 auf dem Endothel (1738 ± 806 Zellen) oder die Inhibition der EphB4 Kinase (1009 ± 334 Zellen) führten zu einer verstärkten Tumorzelldisse-mination, während im Gegensatz dazu eine EphB4 Überexpression zu einer reduzierten ossären Dissemination führte (Knochen: 322 ± 90 Zellen, Weichteilorgane: 612 ± 206 Zellen). Dementsprechend zeigten iΔefnb2 Tiere eine signifikant erhöhte Metastasierung (Kontrolle: 2.815mm3 ± 2.558mm3, iΔefnb2: 9.999mm3± 5.596mm3) mit multiplen spinalen Metastasen (Kontrolle: 1.2 ± 0.4472, iΔefnb2: 3.2 ± 1.643) so-wie ein korrespondierend früher einsetzendes neurologisches Defizit als Kontrolltiere (iΔefnb2 median: 21 Tage, Kontrolle: median: 26 Tage). Unter Überexpression von EphB4 wurde eine signifikante Reduktion spinaler Metastasen beobachtet (B16-luc-pLXSN:1.4 ± 0.5477, B16-luc-EphB4: 0.4 ± 0.5477) mit einem signifikant später ein- setzenden neurologischen Defizit. Die Reinjektion von spinal metastasierten Tumor-zellen (mB16-luc) hatte eine organunspezifische Dissemination zur Folge mit einer unspezifischen Erhöhung spinaler Metastasen (B16-luc: 1.2 ± 0.4472, mB16-luc: 3.8 ± 1.643) und einem früher einsetzenden neurologischen Defizit (B16-luc median: 26 Tage, mB16-luc median: 22 Tage) im Vergleich zur Kontrollgruppe (B16-luc median: 26 Tage, mB16-luc median: 22 Tage). Schlussfolgerung EphrinB2–EphB4-Interaktionen spielen eine zentrale Rolle bei der organspezifi-schen Metastasierung mittels Steuerung der Tumorzelldissemination. Insbesondere bei der Entstehung experimenteller spinaler Metastasen stellt dieser Signalweg damit ein vielversprechendes therapeutisches Ziel dar.