In the first part of this work plants with a reduced cytokinin (CK) status were analyzed regarding their response to high light (HL) stress. A stronger decline in the photosystem II maximum quantum efficiency (Fv/Fm) after HL treatment revealed stronger photoinhibition and hence a higher susceptibility to HL stress in these plants. CK receptor mutant analyses indicated that the CK receptor AHK3 is the key player in mediating this light stress response. In line with the stronger photoinhibtion, D1 protein levels were strongly decreased upon HL stress in CK-deficient plants. Experimentally induced inhibition of D1 repair indicated that this was a consequence of stronger photodamage in these plants. Slow and incomplete recovery in these plants after HL treatment indicated insufficient D1 repair. The total antioxidant capacity was decreased in plants with a reduced CK status. A more detailed analysis of different scavenging mechanisms revealed a pronounced deficiency in carotenoids after HL exposure. A lack of carotenoids could explain both a compromised D1 repair and a stronger photodamage. The second part of this work aimed to uncover a new phenomenon characterized by a pronounced cell death phenotype in plants with a reduced CK status after exposure to changed light- dark regimes. CK synthesis mutants, CKX-overexpressing transgenic plants and CK signaling mutants were affected upon these treatments, revealing the necessity of normal CK levels as well as functional CK signaling for this adaptive response. Also under this kind of stress the receptor AHK3 was found to be the key player. Cell death progression in CK-deficient plants was accompanied by necrotic and water-soaked lesions, loss of membrane integrity, and increased oxidative stress, correlating with a strong induction of stress- and cell death-related genes in the affected leaves. The exposure to different light-dark-temperature regimes clearly demonstrated that, although dependent on prolonged light periods, cell death initiation was not part of a light stress response since it required a dark period following the extended light treatment. Instead, the severity of cell death was determined by a specific interplay between entrainment, treatment, and post-treatment regime pointing to an involvement of the circadian clock. Transcript analyses showed that the induction of stress- and JA-related genes in CK-deficient plants coincided with a strongly diminished CCA1 and LHY expression. Misregulated clock output gene expression also indicated a perturbation of the circadian clock. Intriguingly, the cell death phenotype was also observed in clock mutants lacking proper CCA1 and LHY function. Additionally, these plants exhibited a highly similar molecular phenotype compared with CK-deficient plants regarding clock output, stress and cell death marker, and, interestingly, also A type ARR gene expression. These results confirmed the hypothesis that a malfunction of circadian timekeeping – “circadian stress” – was responsible for the cell death phenotype in CK-deficient plants in response to changed light-dark regimes. A strong upregulation of JA-related and ROS network genes occurred prior to cell death initiation. These early changes in gene expression were not accompanied by increases in JA levels or ROS. The data indicate that the strongly altered transcript levels result from misregulation of clock- controlled genes by a perturbed oscillator and/or disrupted gating of JA and ROS responses. The JA pathway was activated and the accumulation of JA metabolites further amplified JA signaling. CK-deficient plants in the jar1 1 background were partially rescued which confirmed an involvement of JA in cell death development under circadian stress. The misregulation of ROS network genes was probably part of the “death signal”. Genes encoding scavenging enzymes or ferritins exhibited reduced expression in CK-deficient plants during later stages of cell death progression, probably contributing to a disturbed ROS homeostasis and hence promoting cell death development.
Im ersten Teil der Untersuchungen wurden Pflanzen mit reduziertem Cytokinin (CK)-Status bezüglich ihrer Antwort auf Starklicht (SL)-Stress analysiert. Nach SL-Stress war die Effizienz der Photosystem II-Aktivität (Fv/Fm) in diesen Pflanzen stärker vermindert. Dies offenbarte eine stärkere Photoinhibition in CK-defizienten Pflanzen und demnach eine stärkere Empfindlichkeit gegenüber SL-Stress. Zudem zeigte die Analyse verschiedener CK-Rezeptor-Mutanten, dass der AHK3-Rezeptor Hauptvermittler dieser Lichtstress-Antwort ist. Passend zur stärkeren Photoinhibition waren die D1 -Protein-Gehalte nach SL-Stress in CK-defizienten Pflanzen stärker reduziert. Die experimentell induzierte Inhibition der D1-Reparatur zeigte, dass die stärkere Schädigung durch Licht eine Ursache dafür war. Zudem deutete die langsame und unvollständige Recovery nach SL-Stress auf eine unzureichende D1-Reparatur hin. Die antioxidative Kapazität war in Pflanzen mit reduziertem CK-Status vermindert. Die Analyse verschiedener Scavenging-Mechanismen nach SL-Einfluss offenbarte eine deutliche Defizienz an Carotenoiden. Carotenoid- Mangel könnte sowohl eine mangelhafte D1-Reparatur als auch stärkere Schädigung durch Licht erklären. Im zweiten Teil der Untersuchungen sollte ein neuartiges Phänomen charakterisiert werden, bei dem Änderungen im Licht- Dunkel-Regime in CK-defizienten Pflanzen Zelltod auslösen. Pflanzen mit Mutationen im CK-Synthese- oder Signalweg sowie transgene Linien mit CKX- Überexpression waren sensitiv gegenüber diesen Regimes, was die Notwendigkeit normaler CK-Gehalte und eines funktionellen CK-Signalweges für diese adaptive Antwort verdeutlichte. Wie auch beim SL-Stress ist AHK3 hierbei Hauptvermittler. Der Zelltod in CK-defizienten Pflanzen war begleitet von nekrotischen Läsionen, dem Verlust an Frischgewicht und Membranintegrität sowie zunehmendem oxidativen Stress – einhergehend mit der starken Induktion von Stress- und Zelltodmarker-Genen in den betroffenen Blättern. Verschiedene Licht-Dunkel-Temperatur-Regimes wurden getestet und zeigten, dass der Zelltod nicht durch Lichtstress induziert wurde. Obwohl der Zelltodphänotyp mit einer verlängerten Lichtphase in Zusammenhang stand, war eine anschließende Dunkelphase erforderlich, um den Zelltod auszulösen. Insgesamt hing der Schweregrad des Zelltodes vom Anzucht-Regime, der Behandlung selbst sowie vom Folge-Regime ab, was auf eine Beteiligung der circadianen Uhr hindeutete. Transkriptanalysen zeigten, dass die Induktion von Stress- und JA-assoziierten Genen in CK-defizienten Pflanzen mit einer stark reduzierten Expression von CCA1 und LHY korrelierte. Auch fehlregulierte Clock-gesteuerte (Output)-Gene deuteten auf eine Störung der circadianen Uhr hin. Clock-Mutanten mit beeinträchtigter CCA1- und LHY-Funktion zeigten auch den in CK-defizienten Pflanzen beobachteten Zelltod-Phänotyp und wiesen zudem vergleichbare Veränderungen in der Expression von Output-, Stress- und Zelltodmarker- sowie A Typ ARR-Genen auf. Diese Ergebnisse bestätigten die Hypothese, dass eine Störung der circadianen Rhythmik – „circadianer Stress“ – für den Zelltod durch veränderte Licht-Dunkel-Regimes in CK-defizienten Pflanzen verantwortlich war. Die Hochregulation von JA-assoziierten und ROS-Netzwerk- Genen wurde bereits vor Initiation des Zelltodes detektiert, war aber nicht begleitet von erhöhten JA- und ROS-Gehalten. Die Daten deuten darauf hin, dass die stark veränderten Transkriptmengen durch Fehlregulation Clock-regulierter Gene und/oder fehlerhaftes Gating der JA- bzw. ROS-Antwort ausgelöst wurden. Der JA-Weg wurde aktiviert und durch Erhöhung der JA-Metabolit-Level weiter verstärkt. Die partielle Rettung von CK-defizienten Pflanzen im jar1 1-Hintergrund bestätigte eine Beteiligung von JA an der Zelltod-Entwicklung unter circadianem Stress. Die Fehlregulation von ROS-Netzwerk-Genen war vermutlich Teil des Zelltod-auslösenden Signals. Mit fortschreitendem Zelltod war eine zunehmende Repression von Scavenging- und Ferritin-Genen in CK- defizienten Pflanzen zu beobachten, was zur Störung der ROS-Homöostase und damit zur Förderung des Zelltodes beigetragen haben könnte.
