skNAC ist ein herz-sowie skelettmuskelspezifisches Protein, über dessen Funktion noch wenig bekannt ist. Es gibt Hinweise darauf, dass skNAC während der frühen Myogenese als transkriptioneller Kofaktor die Expression verschiedener Gene moduliert. Während späterer Phasen der Muskeldifferenzierung könnte das Protein als eine Art molekulares Chaperon zytoplasmatische Prozesse, insbesondere Myofibrillogenese und Sarkomerogenese, regulieren. Frühere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten zudem nachweisen, dass es bei der Skelettmuskelregeneration sowie bei entzündlichen Skelettmuskelerkrankungen zu einer dramatischen Induktion der skNAC-Expression kommt. Zur skNAC-Genexpression im adulten Nager-Herzen lagen jedoch vor Beginn dieser Arbeit keine Daten vor. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher zunächst das räumliche Expressionsmuster von skNAC in mit Coxsackievirus-B3 (CVB-3)-infizierten Herzen untersucht werden. Coxsackieviren lösen eine Myokarditis im betroffenen Herzen aus. Hierfür wurden Paraffinschnitte von Herzen zweier, für eine CVB-3-induzierte Kardiomyopathie unterschiedlich suszeptible Mäusestämme immunhistochemisch mithilfe eines skNAC-Antiserums untersucht. Jedoch ließen sich mit dem verwendeten Antiserum keine spezifischen Unterschiede bezüglich des Färbemusters zwischen dem Stamm A.BY/SnJ (ABY), welcher nicht in der Lage ist, das Virus zu eliminieren, und dem Stamm C57BL/6 (BL6), welcher das Virus eliminieren kann und i.d.R. keine Kardiomyopathie entwickelt, nachweisen. Im zweiten, skelettmuskelspezifischen Teil der Arbeit sollte dann anhand eines definierten Zellkulturmodells die Funktion von skNAC während der Skelettmuskeldifferenzierung genauer analysiert werden. Dazu untersuchten wir zunächst die Auswirkungen einer Hemmung der skNAC-Expression in C2C12-Skelettmuskelzellen. Hierfür wurde eine Transfektion von C2C12-Zellen mittels einer skNAC-spezifischen siRNA durchgeführt. Anschließend wurden die Zelllysate auf die Expression verschiedener myogener Differenzierungsmarker sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene mittels Northern Blot und Western Blot-Analyse hin untersucht. Hierbei ergab sich zusammenfassend, dass eine Hemmung der skNAC-Expression keinen Einfluss auf die Expression von Myogenin, Desmin, p21, Caveolin-3, Entactin-1 sowie α-Actinin hat. Die Expression von MyHC erschien weder auf RNA- noch auf Proteinebene vermindert, bei einigen Experimenten war auch eine leichte Induktion der Expression auf Proteinebene sichtbar. Hierfür verantwortlich könnten posttranskriptionelle Mechanismen sein. Zudem ergab sich, dass die Morphologie der transfizierten Zellen zwar normal erschien, jedoch erschien die MyHC-Färbung im Vergleich zu den Kontrollen diffus. Dies lässt sich möglicherweise dadurch erklären, dass die Prozesse der Myofibrillogenese / Sarkomerogenese durch eine Hemmung der skNAC-Expression gestört wurden. Da vor Beginn dieser Arbeit noch kein Herzmuskelzellsystem etabliert war, an welchem Untersuchungen zur skNAC-Genexpression und zur Funktion des entsprechenden Protein in Kardiomyozyten durchgeführt werden konnten, wurde geprüft, ob sich die Zelllinie H9c2 dafür eignen könnte. Diese wurde mittels Northern Blot- Analyse auf eine mögliche Expression von skNAC hin untersucht mit dem Ergebnis, dass diese Zelllinie tatsächlich skNAC exprimiert. Sie könnte somit für weitergehende Untersuchungen eingesetzt werden.
skNAC is a heart and skeletal muscle-specific protein. To date, little is known about its functions. Evidence exists that skNAC might act as a transcriptional coactivator during myogenesis. At later stages of myogenic differentiation, the protein might act as a molecular chaperone and could as such regulate cytoplasmic processes, especially myofibrillogenesis and sarcomerogenesis. In addition, in recent studies, we could show that in skeletal muscle regeneration and also in inflammatory skeletal muscle diseases, there is a strong induction of skNAC expression. Finally, at the beginning of this study, little was known on skNAC expression in the adult heart. So, one goal of this study was to examinate the spatial pattern of skNAC expression in coxsackievirus B3 (CVB-3)-infected hearts. Coxsackieviruses can cause myocarditis in infected hearts. Therefore, paraffin sections of hearts from two mousestrains with different susceptibility for CVB-3 were immunohistochemically analyzed with a skNAC-specific antiserum. However, no specific differences with respect to the staining pattern could be found between the two strains A.BY/SnJ (ABY), which is not able to eliminate the virus, and C57BL/6 (BL6), which is able to eliminate the virus without developing a cardiomyopathy. In the second, skeletal muscle-specific part of this study, the function of skNAC in skeletal muscle differentiation was analyzed using an in vitro system. For this purpose, we inhibited skNAC expression in cultured murine C2C12 myoblasts. Specifically, C2C12 cells were transfected with a skNAC-specific siRNA. Subsequently, cell lysates were analyzed for the expression of several myogenic differentiation markers at both the RNA and the protein levels using Northern and Western Blot analysis. We found that inhibition of skNAC-expression has no influence of the expression of Myogenin, Desmin, p21, Caveolin-3, Entactin-1 and α-Actinin. In addition, expression of MyHC was not reduced, by contrast, it appeared even slightly induced at the protein level in some experiments. Most likely, posttranscriptional mechanisms are responsible for this effect. In addition, we found that the morphology of the transfected cells appeared normal, however, their MyHC staining patterns appeared more diffuse in comparison with the controls. This finding suggests that the processes of myofibrillogenesis and/or sarcomerogenesis might be perturbed after inhibition of the skNAC expression. Finally, at the beginning of this study, no in vitro system for the analysis of skNAC functions in cardiomyocytes was available. Thus, we tested if the rat H9c2 cardiomyocyte cell line might be a suitablemodel system. Via Northern Blot analysis, we found that skNAC was indeed expressed in these cells, indicating that the H9c2 line might be a useful model for the analysis of skNAC functions in cardiomyocytes in the future.
